[发明专利]一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法

说明书

本发明公开了一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，包括(1)针对荷斯坦奶牛miRNA前体区域设计特异性引物，对待检奶牛基因组DNA进行PCR扩增，得到扩增产物；(2)利用BspE I限制性内切酶对PCR产物进行酶切，电泳分型，出现3种基因型：TT型、TC型、CC型；(3)CC型在精子活力显著高于TT型，CC型精子畸形率显著低于TT型，因此选择CC型、TC型留种，提高C基因型频率。该方法可提高奶牛精液品质选择的准确性，用于高品质奶牛的选育工作，为加强中国荷斯坦奶牛优良种质提供选育工具。

技术领域

本发明涉及一种荷斯坦奶牛精子活力选择方法，具体为一种荷斯坦奶牛精子活力miRNA分子标记选择方法，属于分子生物学应用领域。

背景技术

miRNA是一类长度在18～24个核苷酸的非编码小分子RNA。它是由一段具有发夹环结构的长度为70～80nt的单链RNA前体(pre-miRNA)剪切后生成。研究发现，miRNA前体在各个物种间具有高度的进化保守性，其茎部保守性强，变异几率非常低，但环部保守性相对较弱。它主要通过与靶标基因3’-UTR(非翻译区)的不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，是基因表达调控的重要因子。

miRNA在生物体的不同组织细胞中、组织发育的不同阶段存在不同的miRNA 表达类型和差异表达量。表明miRNA对基因的表达调控复杂多样，此外，miRNA 自身的转录调控机制也很复杂。miRNA的序列变异对miRNA的生物学合成和功能具有重要影响。研究发现，茎环结构的miRNA前体序列在各个物种间具有高度的保守性，尤其茎部的保守性最强，而环部的保守性相对较弱。miRNA的SNPs 存在于初级miRNA序列、miRNA前体序列及成熟miRNA序列内部。这些SNPs不仅能够影响miRNA的加工过程，还调控miRNA与其靶基因的互作，并进一步影响靶基因表达调控，改变miRNA的生物学功能。

荷斯坦奶牛是目前世界范围内应用最为广泛的奶牛品种，精液品质的优劣是衡量种公牛繁殖力的重要指标，也是种公牛选育中的最基本的衡量指标。精液品质衡量指标包括射精量、精子密度、精子活力、精子形态(畸形率)、精子DNA完整性等指标。精液品质性状受到多种因素的影响，属于复杂的数量性状，具有一定的遗传力，但是遗传力较低，并且不同品种之间的遗传力差异较大(0.04-0.6)。由于传统的表型选择准确性低，且表型值需要在公牛性成熟采精后才能逐步表现出来，周期很长，无法进行超早期选择，遗传进展缓慢。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种荷斯坦奶牛精子活力 miRNA分子标记选择方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种荷斯坦奶牛精子活力 miRNA分子标记选择方法，包括以下步骤，

1)选取56头荷斯坦奶牛，人工采精各1.5ml，测定精液品质数据，并采用常规酚、氯仿法提取精子DNA，电泳及测定OD260/280法检测DNA质量；

2)根据GenBank序列NC_037350.1，利用Primer Premier 6设计一对特异性引物，PCR扩增荷斯坦奶牛miR-6531前体区域序列，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色检测扩增结果；

3)荷斯坦奶牛miR-6531前体区域73位点存在一个T→C突变，产生一个 BspE I酶切位点，利用BspE I限制性内切酶，对所述的扩增产物进行酶切，采用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统拍照，将获得427bp片段的定义为TT型，获得427bp、250bp、177bp三个片段的定义为TC型，获得250bp、177bp两个片段的定义为CC型；

4)采用单因素方差分析比较不同基因型间各精液品质指标的差异，结果表明CC型奶牛个体的精液品质显著高于TT型，选择CC型和TC型个体留种。