[发明专利]用于细胞缺氧和HIF1α蛋白活性指示剂的RCAN1.1启动子片段及其应用

权利要求书

1.一种RCAN1.1启动子片段，其特征在于，所述RCAN1.1启动子片段为RCAN1.1-1030-302启动子片段，该启动子片段为下列序列之一：

1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在保留核心启动子序列的基础上经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列衍生的核苷酸序列。

2.一种指示载体，其特征在于，该指示载体含有根据权利要求1所述的RCAN1.1-1030-302启动子片段和含有报告基因的空白载体pGL3-basic。

3.一种细胞，其特征在于，该细胞系含有权利要求2所述的指示载体。

4.一种工程菌，其特征在于，该工程菌含有权利要求2所述的指示载体。

5.一种利用双荧光素酶报告基因检测HIF1α蛋白表达变化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将生长状态良好、处于对数生长期的HEK293细胞接种到48孔培养板中，37℃、5％C02饱和湿度培养箱中贴壁培养；

S2、构建如权利要求2所述的指示载体；

S3、将指示载体转染入48孔培养板的HEK293细胞中，转染时细胞密度约为70-80％；

S4、转染48小时后，将细胞进行或不进行缺氧处理，检测指示载体中报告基因的表达变化，进而判断指示载体中RCAN1.1-1030-302启动子片段的激活情况，从而判断HIF1α蛋白表达变化。

6.根据权利要求5所述利用报告基因检测HIF1α蛋白表达变化的方法，其特征在于，所述步骤S2构建如权利要求2所述的指示载体的包括步骤：

利用双荧光素酶报告基因检测系统，将RCAN1.1-1030-302启动子片段插入含有报告基因的空白载体pGL3-basic中，构建表达报告基因的重组质粒。

7.根据权利要求5所述利用双荧光素酶报告基因检测HIF1α蛋白表达变化的方法，其特征在于，所述步骤S4中的报告基因为萤火虫荧光素酶报告基因，所述步骤S4中检测指示载体中报告基因的表达具体包括步骤：

1)转染后48小时，将细胞进行或不进行缺氧处理后，立即弃去培养基，用预冷的PBS清洗细胞并加入1×passive lysis buffer细胞裂解液100μL，室温条件下放置在摇床上裂解20min至细胞完全裂解；

2)将细胞裂解液收集转移到1.5mL的EP中，涡旋振荡器震荡混匀15秒，4℃条件下12000g离心5min后，取上清置于冰上待测；

3)采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒，在新的EP管中依次加入2μL细胞上清液，再加入10μL萤火虫荧光素酶分析试剂II充分混匀，应用GloMax TM bioluminimeter单管分光光度计检测荧光素酶活性；然后加入10μL StopGlo Reagent(RL)，读数10s检测海肾荧光素酶内参活性，两组数值比即为相对荧光素酶单位RLU。

8.一种利用报告基因检测HIF1α蛋白表达变化的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的指示载体或权利要求3所述的细胞或权利要求4所述的工程菌。