[发明专利]用于细胞缺氧和HIF1α蛋白活性指示剂的RCAN1.1启动子片段及其应用

说明书

本发明公开了一种用于细胞缺氧和HIF1α蛋白活性指示剂的RCAN1.1启动子片段及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明采用双荧光素酶报告基因检测系统，将RCAN1.1‑1030‑302启动子片段插入带有萤火虫荧光素酶报告基因的空白载体pGL3‑basic中，构建了表达萤光虫荧光素酶的重组质粒RCAN1.1‑1030‑302‑LUC，通过检测其荧光素酶活性，来判断RCAN1.1‑1030‑302‑LUC启动子片段的激活情况，进而判断细胞的缺氧状态和HIF1α蛋白活性。本发明提供的RCAN1.1‑1030‑302启动子片段能够被HIF1α蛋白激活，且对HIF1α蛋白具有高度的敏感性，能够作为细胞缺氧和HIF1α蛋白活性指示剂。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于细胞缺氧和HIF1α蛋白活性指示剂的RCAN1.1-1030-302启动子片段及其应用。

背景技术

RCAN1基因位于位于唐氏综合症关键区域(Down Syndrome Critical Region，DSCR)，包括7个外显子和6个内含子，其中前4个外显子为选择性外显子，不同的表达可以产生4种不同的蛋白亚型，其中最主要的是外显子1编码的RCANl.1和外显子4编码的RCANl.4。RCAN1基因有两个转录起始位点，分别位于外显子1和外显子4前面，外显子5，6，7编码的168个氨基酸为高度保守区域，在所有RCAN1亚型中均表达，并包含有钙调磷酸酶结合域。研究表明，RCAN1对钙调磷酸酶的信号转导通路具有双重调控作用，并参与了核转录因子NF-kB信号通路的调控，在细胞凋亡、细胞分化和记忆等生理过程中都有非常重要的调节作用，被认为与多种疾病相关。研究发现在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者中，RCAN1高度过量表达且AD患者大脑中Aβ的大量沉积直接引起RCAN1的表达增加，上调的RCAN1抑制了钙调磷酸酶的活性，使得去磷酸化作用减弱，高度磷酸化的tau蛋白累积，导致螺旋状的神经原纤维缠结，进一步导致神经元死亡，加重了AD的症状。另有研究发现在脑缺血缺氧时，神经元中RCAN1.1蛋白表达水平明显升高，在大脑缺血性损伤和神经炎性病变中起到一定的保护作用。众多的研究结果提示，RCAN1对多种疾病的发生发展都具有重要作用。

哺乳动物和人体内细胞存在着一类介导低氧适应性反应的转录因子，能激活许多低氧反应性基因(hypoxia responsive genes，HRG)的表达，是在低氧条件下维持氧稳态的关键性物质，称低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor，HIF1)。HIF1转录因子包括两个亚单位，即低氧调控的α亚单位(HIF1α)和对氧不敏感的β亚基HIF1β，其中HIF1α是决定HIF1功能的关键亚基。人HIF1α的基因位于第14号染色体(14q21-4)上，属于HIFs(hypoxiainducible factors,HIFs)家族。研究表明，细胞低氧状态可诱导HIF1α的表达，其在体内介导的生理或病理作用主要通过与目的基因的低氧反应元件(Hypoxia response element,HRE)结合而调节目的基因的表达来实现。现已发现受HIF1α调控的下游目的基因包括促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)、诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric-oxide synthase,iNOS)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)等五十多种基因的表达，进而来介导机体的一系列低氧适应性反应如红细胞生成，血管舒张，血管生成和糖酵解等等。因此，HIF1α参与多种生理过程，对多种疾病均有调控作用，HIF1α蛋白活性的检测意义重大。