[发明专利]一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用在审
| 申请号： | 202111289115.3 | 申请日： | 2021-11-02 |
| 公开（公告）号： | CN114107379A | 公开（公告）日： | 2022-03-01 |
| 发明（设计）人： | 刘彦梅;付苏雷;费继锋;曾雁云;胡燕;王鹍 | 申请（专利权）人： | 华南师范大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/89;C12N15/90;C12N15/12;C12N15/113;C12N9/22;C12N15/53;A01K67/027;A61K49/00 |
| 代理公司： | 广州市华学知识产权代理有限公司 44245 | 代理人： | 刘瑜 |
| 地址： | 510631 广东省广州*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 神经 干细胞 特异性 消融 动物 模型 构建 方法 及其 应用 | ||
1.一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)通过将Sox2基因的ORF序列、T2A序列以及CherryNTR序列连接到pGEM-T质粒上，构建得到knockin转基因所需的供体质粒pGEMT:Sox2-ORF-T2A-CherryNTR；其中，Sox2基因的ORF序列如SEQ ID NO：1所示，T2A序列如SEQ ID NO：2所示，CherryNTR序列如SEQ ID NO：3所示；
(2)将Cas9蛋白、gRNA序列与步骤(1)中构建得到的供体质粒pGEMT:Sox2-ORF-T2A-CherryNTR混合后注射到单细胞时期的墨西哥钝口螈受精卵中，在16～20℃条件下进行孵化，直到孵化完成，发育成幼体，通过表型观察及基因型鉴定，筛选得到F0代Sox2:CherryNTR转基因动物，继续将幼体饲养至成年并进行繁育，得到稳定遗传的Sox2:CherryNTR转基因动物；
(3)用硝基还原酶的底物处理Sox2:CherryNTR转基因动物后，继续常规饲养，得到所述的神经干细胞特异性消融动物模型。
2.根据权利要求1所述的神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的gRNA序列如SEQ ID NO：4所示。
3.根据权利要求1所述的神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的硝基还原酶的底物为甲硝唑和硝呋吡醇中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于：
所述的甲硝唑的使用浓度为5～20mmol/L；
所述的硝呋吡醇的使用浓度为2.5～20μmol/L。
5.根据权利要求4所述的神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于：
所述的甲硝唑的使用浓度为20mmol/L；
所述的硝呋吡醇的使用浓度为7.5μmol/L。
6.根据权利要求1所述的神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的墨西哥钝口螈为d/d墨西哥钝口螈；
步骤(3)中所述的Sox2:CherryNTR转基因动物的体长为2～4cm。
7.根据权利要求1所述的神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的处理的方式为水浴处理或腹腔注射；
步骤(3)中所述的处理的时间24h以上。
8.根据权利要求1所述的神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的饲养的时间为1～20天。
9.按照权利要求1～8任一项所述的构建方法构建得到的动物模型在筛选预防和/或治疗神经干细胞相关疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述的神经干细胞相关疾病为小头畸形，帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病，脑损伤，脊髓损伤或精神分裂症。
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