[发明专利]一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用。该构建方法包括如下步骤：(1)通过将Sox2基因的ORF序列、T2A序列以及CherryNTR序列连接到pGEM‑T质粒上，构建所需的供体质粒；(2)将Cas9蛋白、gRNA序列与供体质粒混合后注射到单细胞时期的墨西哥钝口螈受精卵中，经孵化、发育成幼体、鉴定和筛选、繁育，得到稳定遗传的Sox2:CherryNTR转基因动物；(3)用硝基还原酶的底物处理Sox2:CherryNTR转基因动物，得到神经干细胞特异性消融动物模型。本发明构建的动物模型可用于研究神经干细胞相关疾病的发病机制或开发与神经干细胞相关疾病的治疗方法或药物。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种神经干细胞特异性消融动物模型的构建方法及其应用。

背景技术

细胞是生命活动的基本单位，多细胞生物的所有生理及病理过程都是由多种细胞参与的复杂过程，研究各种细胞的功能对于理解生命活动具有重要的意义。神经干细胞是一种具有多向分化潜能的多能干细胞，可以分化为各种类型的神经元和胶质细胞，是神经系统形成的基础。神经干细胞功能异常不仅会导致中枢神经系统发育缺陷，还可能与神经系统疾病的发生有关，如帕金森病、阿尔茨海默病(AD)、亨廷顿病等^[1]；而且神经干细胞是中枢神经系统损伤再生的细胞来源，包括人类在内的大多数高等动物随着生长发育，中枢神经系统内神经干细胞数量逐渐减少，再生能力逐渐减弱，并最终消失。对神经干细胞功能的研究可以帮助我们更深入理解神经系统发育及再生的细胞机制并为治疗神经损伤性疾病提供有潜力的治疗策略。

墨西哥钝口螈是一种具有强大再生能力的两栖类动物，不仅可以再生四肢及尾部，还可以几乎完美的修复中枢神经系统损伤。与包括人类在内的大多数高等动物不同，墨西哥钝口螈中枢神经系统终身存在大量神经干细胞，在脊髓损伤后，损伤位点头端500微米区域的神经干细胞在损伤后被激活，重新“年轻化”，表现出类似于胚胎发育早期神经干细胞的状态，随后迅速增殖，迁移，分化为神经元并重建神经环路，且再生脊髓组织与损伤前比较，无形态学差异^[2-3]，与斑马鱼的脊髓再生相比，墨西哥钝口螈脊髓再生是在细胞生物学及功能水平上对损伤脊髓的精确重建。利用墨西哥钝口螈脑损伤模型的研究表明，再生的脑组织重新生成了损伤前全部的细胞类型，神经干细胞是其再生的细胞来源^[4]。利用墨西哥钝口螈研究中枢神经系统损伤后再生的分子及细胞生物学机制，特别是神经干细胞在中枢神经系统损伤再生过程中的功能，将为改善人类中枢神经系统再生提供理论基础。

靶向细胞消融是研究细胞功能的重要方法，但目前在模式动物墨西哥钝口螈中尚未建立任何靶细胞消融方法。虽然在小鼠，斑马鱼等物种中已经开发了多种细胞特异性消融方法，如Diphtheria toxin A^[6]，Kid/Kis^[7]，HSV tymidine kinase/ganciclovir^[8]，Tamoxifen-inducible c-Myc^[9]等，但未见有应用于神经干细胞消融的方法；而且这些方法各有缺点^[5]，例如：Diphtheria toxin A细胞消融系统有严重的旁观者效应^[6]；Kid/Kis系统不仅需要在靶细胞中表达细菌毒素Kid，另外还需在非靶细胞中表达抗毒素Kis^[7]；HSVtymidine kinase/ganciclovir系统仅对增殖细胞有效^[8]；Tamoxifen-inducible c-Myc系统需要较长的时间才能使的靶细胞消融^[9]。因此，在模式动物墨西哥钝口螈中建立一种高效消融神经干细胞的方法不仅具有方法学意义，还具有重要的应用价值。

参考文献：

[1]Winner,Beate,and Jürgen Winkler.Adult neurogenesis inneurodegenerative diseases.Cold Spring Harbor perspectives in biology 7.4(2015):a021287.