[发明专利]一种可用于新冠病毒中和抗体活性评价和作为核酸检测标准物的假病毒颗粒及其制备方法

权利要求书

1.一种假病毒颗粒，其特征在于：

以慢病毒为框架；

其外膜蛋白是VSV-G蛋白与新冠病毒S蛋白受体结合基序融合的外膜蛋白；

其核心基因为SARS-CoV-2病毒基因片段；

所述SARS-CoV-2病毒基因片段为该病毒7个RNA片段的串联体；

所述7个RNA片段分别为该病毒基因的13340-13462位碱基、15430-15530位碱基、22721-22861位碱基、26269-26382位碱基、28706-28834位碱基、28880-28981位碱基、29741-29890位碱基。

2.根据权利要求1所述假病毒颗粒，其特征在于：

所述新冠病毒S蛋白受体结合基序是新冠病毒S蛋白的437-508位氨基酸。

3.权利要求1或2所述假病毒颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建VSV-G与新冠病毒S蛋白受体结合基序融合表达载体

1.1)对pMD2.G载体上VSV基因进行酶切，回收载体大片段DNA；

1.2)处理步骤1.1)回收的载体大片段DNA，防止载体自连；

1.3)合成SEQ ID No.1DNA，该序列包含了去除终止码的VSV-G编码DNA和含终止码的RBM DNA，并在两端引入酶切位点；

1.4)以内切酶处理步骤1.3)合成的SEQ ID No.1DNA，回收SEQ ID No.1DNA；

1.5)将步骤1.2)处理过的载体大片段DNA与步骤1.4)回收的SEQ ID No.1DNA混合，进行酶连，得到连接产物；

1.6)将步骤1.5)得到的连接产物进行转化，并筛选阳性克隆，得到VSV-G与RBM融合表达载体；

2)构建包含新冠病毒七段RNA片段串联体的慢病毒表达载体

2.1)合成SEQ ID No.2DNA，该序列包含了六段国内外权威机构指定的新冠病毒核酸检测扩增区域及一段包含poly-A的3’非编码区域，并在两端引入酶切位点；

2.2)将步骤2.1)合成的SEQ ID No.2DNA克隆至慢病毒表达载体，得到包含新冠病毒七段RNA片段串联体的慢病毒表达载体；

3)转染技术包装得到假病毒颗粒

利用步骤1)得到的VSV-G与RBM融合表达载体和步骤2)得到的包含新冠病毒七段RNA片段串联体的慢病毒表达载体，转染包装得到假病毒颗粒。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：

步骤1.2)中，采用碱性磷酸酶处理步骤1.1)回收的载体大片段DNA；

步骤1.5)中，采用T4连接酶进行酶连。

5.根据权利要求3或4所述制备方法，其特征在于：

步骤2)中，慢病毒表达载体为FT102 CMV-MCS-EF1-copGFP。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于：步骤3)的具体步骤为：

3.1)用DMEM高糖培养基培养293T细胞，置于37℃的CO₂恒温细胞培养箱培养；

3.2)接种293T细胞于孔板中，使细胞达到70-90％汇合度；

3.3)按照四质粒系统包装病毒颗粒；

转染时要求按照慢病毒表达载体质粒、pMD2.G质粒、pMDLg/pRRE质粒、pRES rev质粒质量比为7:5:5:2～5的量制备DNA预混液，与已稀释的转染试剂形成DNA-脂质复合物，将其加入步骤3.2)的细胞后，37℃孵育；

3.4)分别于转染后第24h、48h收集细胞上清液，将其合并后超滤浓缩。