[发明专利]一种壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶及其制备方法

说明书

本发明公开了一种壳聚糖‑羧甲基纤维素固定化酶的制备方法，其包括以下步骤：分别配置壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液，将两种溶液混合形成混合溶液，配置木瓜蛋白酶溶液，以及在液体石蜡、石油醚中加入乳化剂形成油相预混液，然后在搅拌条件下，将混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，重复步骤⑥1h，⑦降温固化壳聚糖‑羧甲基纤维素微球，将微球洗涤后真空冻干，在将冻干的壳聚糖‑羧甲基纤维素微球加入浓度为木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附，再加入戊二醛溶液交联，后洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖‑羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶。本发明制得的壳聚糖‑羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶，微球孔隙多可负载更多的木瓜蛋白酶。

技术领域

本发明涉及固定化酶的技术领域，尤其是一种壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶及其制备方法。

背景技术

固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。

如中国专利公开号为CN105316232A的《一种用于固定化酶制备反应的装置及其应用》所公开的，目前固定化酶最常用的制备方法有交联法和包埋法。

交联法是指借助多功能试剂使游离酶的氨基酸残基与双官能团或多官能团交联剂反应而发生交联的固定化方法。常用的双功能试剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2-2’-二磺酸等，常用的多功能试剂为甲苯-2-异氰-4-异硫氰，其中应用最广泛的是戊二醛。戊二醛具有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成Schiff碱，从而使酶分子交联，制成固定化酶。

包埋法是将酶包埋在多孔载体中使酶固定的方法，其制备工艺简便且条件较为温和。载体不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，可获得较高的酶活力回收率。因此，相对来说，采用包埋法制备的固定化酶具有更大的优势。然而，由于包埋法制备固定化酶常用的载体如明胶、琼脂、琼脂糖、壳聚糖、海藻酸钠等，都具有高粘度的特性，因此制备过程中存在成型难、生产效率低的技术问题，以致无法实现大规模工业化生产。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶的制备方法，该方法制得的微球形状规整、粒径均一、具有层级结构，其孔隙、层级间隙多可负载更多的木瓜蛋白酶。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为1～4mg/ml壳聚糖醋酸溶液，②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1～2mg/ml的羧甲基纤维素溶液，③将羧甲基纤维素溶液壳聚和糖醋酸溶液混合均匀，形成混合溶液，④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入乳化剂形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2-3%，⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，重复步骤⑥1h，⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中，羧甲基纤维素在壳聚糖-羧甲基纤维素微球中的质量百分比为11-20%，⑧将冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶。

进一步的，所述乳化剂为司盘60、司盘40或司盘20。

进一步的，所述步骤⑧中，壳聚糖-羧甲基纤维素微球与木瓜蛋白酶的重量比为1000：1.16-1000:2.05。