[发明专利]一种核酸代谢酶活性检测方法

说明书

本发明涉及一种核酸代谢酶活性检测方法，其步骤如下：S1，人工合成一条单链核酸片段和一段从3′端互补的引物，通过退火反应形成模板；S2，将模板、反应缓冲液、荧光修饰的核苷酸衍生物或荧光修饰的核苷酸衍生物类似物、待测定的核酸代谢酶进行反应并纯化得到初次纯化产物；S3，将初次纯化产物、Taq反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶进行反应并纯化得到二次纯化产物；S4，对二次纯化产物用毛细管电泳仪分析；S5，制作标准曲线，将S4中结果代入标准曲线得出检测结果。该发明操作快捷，活性检测结果准确、灵敏度高，实现了高通量的检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种核酸代谢酶活性检测方法。

背景技术

核酸代谢，包括DNA和RNA合成和降解，是所有核酸研究和相关生命科学领域研究的基础。参与DNA复制和修复的核酸代谢酶的标准活性检测方法是通过检测测量DNA或RNA的产物合成或降解放射性或荧光标记的核酸底物。例如，用同位素标记的方法，结合DNA的荧光染料法(PicoGreen或EvaGreen)均广泛应用于DNA定量，进而应用于核酸代谢酶的活性检测方法中，测定核酸代谢酶的合成活性或者降解活性。为了更好地研究反应中间体或副产物，更全面的捕获反应途径的具体步骤和细节，全面了解核酸酶的活性，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)被广泛的应用于分析底物，中间体的大小分布等实验研究中，对核酸酶进行进一步的表征和标准测定，但聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析方法相对于前述的放射性或荧光标记法，存在着实验时间长效率低通量小等缺点，限制了核酸酶分析的范围。

发明内容

针对现有的不足，本发明提供一种核酸代谢酶活性检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种核酸代谢酶活性检测方法，其特征在于:其步骤如下：

S1，人工合成一条单链核酸片段和一段从3′端互补的引物，通过退火反应形成核酸引物复合物，称之为模板；

S2，将模板、反应缓冲液、荧光修饰的核苷酸衍生物或荧光修饰的核苷酸衍生物类似物、待测定的核酸代谢酶加入同一个PCR管中，在PCR反应仪中反应得到初始产物，并对初始产物进行kit纯化得到初次纯化产物；

S3，将初次纯化产物、Taq反应缓冲液、dNTP、Taq DNA聚合酶加入另一个PCR管中，在PCR反应仪中反应得到二次反应产物，并对二次反应产物进行kit纯化得到二次纯化产物；

S4，对二次纯化产物用毛细管电泳仪分析，收集分离图谱并计算出单位时间内碱基的延伸效率；

S5，制作标准曲线，将S4中并分析计算延伸效率代入标准曲线得出待测定核酸代谢酶的活性；其中步骤S2和S3中的PCR反应条件是温度为10℃—90℃，时间为10s—60min。

作为优选，所述模板为一条单链核酸片段，其片段长度为50-150个bp。

作为优选，所述引物长度为15-25个bp。

作为优选，所述步骤S2的反应条件是温度为45-65℃，时间为1min。

作为优选，所述步骤S3的反应条件是温度为72℃，时间为20min。

作为优选，所述标准曲线的制备方法为，在步骤S2中将待测定的核酸代谢酶改为按照活性梯度稀释成不同浓度的已知活性的核酸代谢酶，然后依次经过S2、S3、S4步骤得出各种梯度单位活性初始斜率，并制出标准曲线。

作为优选，所述步骤S2中，待测定的核酸代谢酶按照浓度梯度稀释成不同浓度的核酸代谢酶，然后每一个浓度的核酸代谢酶均依次经过S2、S3、S4步骤得出各浓度单位活性初始斜率，并代入标准曲线中，得出相对活性单位。

作为优选，所述毛细管电泳仪分析依据荧光染料的种类、分离图谱的峰型大小来计算的。