[发明专利]检测人类RET基因M918T突变的试剂盒、反应体系及方法

权利要求书

1.检测人类RET基因M918T突变的试剂盒，其特征在于，所述检测人类RET基因M918T突变的试剂盒包括：

引物组合，所述引物组合包括上游引物和下游引物；

探针组合，所述探针组合包括检测M918T突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针；

第一试剂包和第二试剂包，所述第一试剂包和第二试剂包各自包含PCR缓冲液，dNTP，MgCl2，特异性探针，锁核酸引物，内标系统，HotStartTaq酶、UNG酶，其中第一试剂包还包含引物对SEQIDNO:11和SEQIDNO:22，探针SEQIDNO:33，第二试剂包包含引物对SEQIDNO:111和SEQIDNO:44，探针SEQIDNO:55，其中SEQIDNO:44为锁核酸引物。

2.如权利要求1所述的人类RET基因M918T突变的检测试剂盒，其特征在于，探针SEQIDNO:33、SEQIDNO:55的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团，所述荧光基团可以为FAM、VIC或HEX。

3.如权利要求1所述的人类RET基因M918T突变的检测试剂盒，其特征在于，第一试剂包和第二试剂包中均含有ROX参比校正，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有M918T突变质粒DNA，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。

4.快速检测权利要求1所述的人类RET基因M918T突变的方法，该方法包括以下步骤：

(1)设计并筛选含有人类RET基因质控的引物、探针，含有检测M918T突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针，上游引物和下游引物；

(2)获得待测样品基因组DNA；

(3)取权利要求1-3中任一项所述的检测试剂盒，将所述基因组DNA先后取相同的量加入所述第一试剂和所述第二试剂中并同时进行PCR反应，根据两个PCR反应体系分别得到的Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。

5.检测人类RET基因M918T突变的方法，该方法利用权利要求1至4任一项所述的检测试剂盒进行，该方法包括以下步骤：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)将上述获得的基因组DNA先后取同样量分别加入含有本发明的检测试剂盒中第一试剂包的PCR反应体系和含有本发明的检测试剂盒中第二试剂包的PCR反应体系中，并使该两个反应体系同时进行PCR反应，两个PCR反应彼此独立进行，根据两个PCR反应体系分别得到的Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，根据以下条件进行所述判断：

△Ct9则待测样品存在RET基因M918T突变；△Ct值≥9则待测样品无RET基因M918T突变或突变丰度低于本试剂盒突变检测下限。

7.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，还包括对上样量是否合适进行判断的步骤，判断依据如下：

Ct0≤32则上样量合适，检测结果有效；Ct032则上样量偏低，需增加上样量后重新检测，

其中，所述Ct0为所述第一试剂包对应的Ct值。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述△Ct值≥9的情况包括所述第二试剂包进行PCR反应后无Ct值的情况。

9.如权利要求4-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR反应条件为：

95℃4～11min；

95℃15～30s，60℃45～60s，40～48个循环。

10.如权利要求4-8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR反应条件优选为：

38℃9min；

95℃5min；

95℃15s，60℃60s，48个循环。