[发明专利]检测人类RET基因M918T突变的试剂盒、反应体系及方法

说明书

本发明公开了检测人类RET基因M918T突变的试剂盒、反应体系及方法，本发明涉及RET基因技术领域，检测人类RET基因M918T突变的试剂盒包括：引物组合，引物组合包括上游引物和下游引物；探针组合，探针组合包括检测M918T突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针；第一试剂包和第二试剂包；本发明的有益效果在于：该试剂盒针对RET基因M918T突变设计了特定序列的引物和特定序列的探针，在优化的反应体系中通过digital PCR平台的方法，实现对RET基因M918T的突变的高灵敏度检测，并且在检测M918T突变的阴阳性的同时还可以获得样本中该突变的比例，为甲状腺癌M918T突变患者治疗提供用药指导。

技术领域

本发明涉及RET基因技术领域，尤其是涉及检测人类RET基因M918T突变的试剂盒、反应体系及方法。

背景技术

RET基因，是一个原癌基因，位于人染色体10q11.2，大小约为60kb，包含21个外显子，编码1100个氨基酸的酪氨酸激酶受体超家族RET蛋白，在正常的神经元、交感神经和副交感神经节、甲状腺C细胞、肾上腺髓细胞、泌尿生殖细胞、睾丸生殖细胞都有表达，RET蛋白活化后会激活下游的信号通路（包括RAS、MAPK、ERK、PI3K、AKT等），导致细胞增殖、迁移和分化，但是现在始终难以实现对RET基因M918T的突变进行高灵敏度检测，并且在检测M918T突变的阴阳性的同时难以获得样本中该突变的比例，进而难以为甲状腺癌M918T突变患者治疗提供用药指导。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少缺陷，提供检测人类RET基因M918T突变的试剂盒，所述检测人类RET基因M918T突变的试剂盒包括：

引物组合，所述引物组合包括上游引物和下游引物；

探针组合，所述探针组合包括检测M918T突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针；

第一试剂包和第二试剂包，所述第一试剂包和第二试剂包各自包含PCR缓冲液，dNTP，MgCl2，特异性探针，锁核酸引物，内标系统，HotStartTaq酶、UNG酶，其中第一试剂包还包含引物对SEQIDNO:11和SEQIDNO:22，探针SEQIDNO:33，第二试剂包包含引物对SEQIDNO:111和SEQIDNO:44，探针SEQIDNO:55，其中SEQIDNO:44为锁核酸引物。

更佳的，探针SEQIDNO:33、SEQIDNO:55的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团，所述荧光基团可以为FAM、VIC或HEX。

更佳的，第一试剂包和第二试剂包中均含有ROX参比校正，所述检测试剂盒含有阳性对照液和空白对照液，所述阳性对照液含有M918T突变质粒DNA，所述空白对照为Tris-HCl缓冲液。

本发明根据以上所述提供检测人类RET基因M918T突变的方法，该方法包括以下步骤：

(1)设计并筛选含有人类RET基因质控的引物、探针，含有检测M918T突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针，上游引物和下游引物；

(2)获得待测样品基因组DNA；

(3)取以上所述的检测试剂盒，将所述基因组DNA先后取相同的量加入所述第一试剂和所述第二试剂中并同时进行PCR反应，根据两个PCR反应体系分别得到的Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。

本发明根据以上所述提供检测人类RET基因M918T突变的方法，该方法包括以下步骤：

(1)获得待测样品基因组DNA；

(2)将上述获得的基因组DNA先后取同样量分别加入含有本发明的检测试剂盒中第一试剂包的PCR反应体系和含有本发明的检测试剂盒中第二试剂包的PCR反应体系中，并使该两个反应体系同时进行PCR反应，两个PCR反应彼此独立进行，根据两个PCR反应体系分别得到的Ct值的差值△Ct判断是否具有相应的基因突变。

更佳的，根据以下条件进行所述判断：