[发明专利]产生基于类泛素或泛素蛋白的生化工具的方法在审
| 申请号： | 202111301856.9 | 申请日： | 2021-11-04 |
| 公开（公告）号： | CN114181993A | 公开（公告）日： | 2022-03-15 |
| 发明（设计）人： | 刘磊;王天;王玫景;何伟;李春瞳;李景虹 | 申请（专利权）人： | 清华大学 |
| 主分类号： | C12Q1/37 | 分类号： | C12Q1/37;C07K14/47;G01N30/02;G01N30/72 |
| 代理公司： | 北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙) 11201 | 代理人： | 孙诗惠 |
| 地址： | 10008*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 产生 基于 类泛素 蛋白 生化 工具 方法 | ||
1.一种产生用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具的方法，其特征在于，在蛋白酶Lbpro的存在下，使成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体与甘氨酰化工具分子接触，从而获得所述用于评价类泛素或泛素蛋白去修饰酶活性的生化工具。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自：具有SEQ ID NO:2所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15、具有SEQ ID NO:3所示序列的成熟化类泛素蛋白NEDD8、具有SEQ ID NO:4所示序列的成熟化泛素Ub或具有SEQ ID NO:5所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15(C78S)突变体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘氨酰化工具分子选自Gly-PA、Gly-Br3、Gly-VME、Gly-Gly-AMC或Gly-Gly-Rho-Gly-Gly。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至1000:1，优选地50:1至800:1，更优选地400:1至500:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-PA、Gly-Br3或Gly-VME。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至100:1，优选地50:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-Gly-AMC。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述甘氨酰化工具分子与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为20:1至80:1，优选地40:1，其中所述甘氨酰化工具分子是Gly-Gly-Rho-Gly-Gly。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶Lbpro与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为1:100至1:2000，任选地1:500至1:1000，其中所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自具有SEQ ID NO:2所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15或具有SEQ ID NO:5所示序列的成熟化类泛素蛋白ISG15(C78S)突变体。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶Lbpro与所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体的摩尔浓度比为1:20至1:30，优选地1:25，其中所述成熟化类泛素或泛素蛋白或其变体选自具有SEQ ID NO:3所示序列的成熟化类泛素蛋白NEDD8或具有SEQ ID NO:4所示序列的成熟化泛素Ub。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在室温下进行，可选地，所述方法在pH为7-9，优选pH为8.5下进行。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在Tris-HCl或Tris-HCl:DMSO中进行，任选地Tris-HCl与DMSO的体积比为1:10至10:1、优选为1:5至5:1、更优选地为1:1。
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