[发明专利]一种新型蛋白质生物素连接酶及基于其的邻近标记系统PhastID

说明书

本发明公开了一种新型蛋白质生物素连接酶及基于其的邻近标记系统PhastID。具体公开了蛋白质生物素连接酶BPL及改造后的突变蛋白质生物素连接酶BPL*及基于上述生物素连接酶BPL或BPL*的邻近蛋白标记系统PhastID。所述包含蛋白质生物素连接酶BPL*的标记系统，相比与传统的BioID邻近标记系统，其标记强度更高，所需标记时间更短，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及新型蛋白质生物素连接酶BPL及经过突变的蛋白质生物素连接酶融合蛋白BPL*及基于上述蛋白质生物素连接酶BPL或BPL*的邻近标记系统PhastID。

背景技术

蛋白质生物素连接酶可以通过活化生物素(Biotin)形成生物素酰-5’-腺苷酸Biotinyl-5’-AMP，将生物素标记到其底物上。而经过人工改造，该连接酶可失去对底物的特异性标记，释放的Biotinyl-5’-AMP化学性质极不稳定，可随机与邻近的赖氨酸残基发生反应，使其共价标记生物素，该范围约为10nm以内。结合生物素与链霉亲和素之间的高亲和力和稳定性，可对蛋白进行示踪、纯化等操作。由于其标记半径约为10nm，该距离恰好是蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)的前提，因此在蛋白质组学中具有广泛的应用前景。近年来，利用生物素连接酶进行邻近蛋白标记技术发展迅猛，这种技术首先将目的蛋白与生物素连接酶形成融合蛋白，经过一定时间的Biotin标记后，通过生物素-链霉亲和素系统，纯化出目的蛋白周围被生物素连接酶标记的蛋白，再通过高通量的方法进一步鉴定出与之有相互作用的蛋白。目前，已有多种物种的生物素连接酶，经突变后发展为邻近标记技术被报道，包括BioID(BirA*，来自Escherichia coli，参考文献：Roux KJ,Kim D I,Raida M,et al.A promiscuous biotin ligase fusion protein identifiesproximal and interacting proteins in mammalian cells[J].J Cell Biol,2012,196(6):801-810.)、BioID2(BPL，来自Aquifex aeolicus，参考文献：Kim D I,Jensen S C,Noble K A,et al.An improved smaller biotin ligase for BioID proximitylabeling[J].Molecular biology of the cell,2016,27(8):1188-1196.)、RapID(BASU，来自Bacillus subtilis，参考文献：Ramanathan M,Majzoub K,Rao D S,et al.RNA–protein interaction detection in living cells[J].Nature methods,2018,15(3):207.)和TurboID(突变自BirA*，参考文献：Branon T C,Bosch J A,Sanchez AD,etal.Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID[J].Nature biotechnology,2018,36(9):880-887)。但由于这些邻近标记技术均存在一定缺陷，如：标记能力较弱，故所需时间较长，在检测瞬时或弱相互作用蛋白时能力较弱；或酶的蛋白分子量较大。因此，寻找一种新型的，在结构及功能上都更具优势的生物连接酶具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种新型蛋白质生物素连接酶BPL。

本发明的第二个目的在于提供一种突变蛋白质生物素连接酶BPL*。

本发明的第三个目的在于提供所述蛋白质生物素连接酶BPL或突变蛋白质生物素连接酶BPL*的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种包含上述蛋白质生物素连接酶BPL或突变蛋白质生物素连接酶BPL*的邻近标记系统。