[发明专利]酵母细胞线粒体移植乳腺肿瘤细胞的构建培养方法

权利要求书

1.一种酵母细胞线粒体移植乳腺肿瘤细胞的构建培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将平板培养基上的酿酒酵母菌接种于液体培养基中，放置于摇床培养至对数生长期，得酿酒酵母细胞；

（2）将液体培养基倒入离心管中，经多步差速离心法，获得酵母细胞线粒体粗提物；

（3）将酵母细胞线粒体粗提物置于超速离心管中，利用蔗糖密度梯度离心法，获取纯化的酵母细胞线粒体；

（4）将纯化的酵母细胞线粒体以190μg/ml的浓度添加至96孔板培养的MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞的培养液中，共孵育培养12小时，即得到含有酵母细胞线粒体的乳腺肿瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的构建培养方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酿酒酵母细胞具体的培养方法为：

1）称取2.5%葡糖糖、2.5%蛋白胨、1%酵母浸粉，用蒸馏水溶解，定容；

2）将培养基分装至锥形瓶中，经115℃高压灭菌15-20分钟，按2-10%的接种量将酿酒酵母菌接入培养基中，30-35℃摇床培养36-48小时即可。

3.根据权利要求1所述的构建培养方法，其特征在于，步骤（2）中，所述酵母细胞线粒体粗提物的具体获取步骤为：

1）将液体培养基4000g×5min离心，收集细胞；

2）采用蒸馏水重悬细胞，洗去细胞表面的培养基，重复一次；

3）称量细胞重量，按照2.5ml/g细胞加缓冲液A重悬细胞，30-35℃振摇20-30分钟，而后4000g×5min离心收集细胞；

4）将收集的细胞用缓冲液重悬，将细胞洗两次；

5）将每克细胞（湿重）中加入35mg蜗牛酶，并按照4ml/g加入缓冲液B，在37℃保温1-2h，获得原生质体，然后10000g×10min离心，收集沉淀；

6）加入与原生质体体积相等的玻璃珠，并按照5ml/g加入缓冲液C，在旋涡震荡仪上破碎细胞，而后1500g×5min离心，收集上清液，将沉淀重复破碎离心一次，合并两次的上清液；

7）将上清液4000g×5min离心，收集沉淀，用2.5ml/g的缓冲液C重悬沉淀，13000g×15min离心，收集线粒体沉淀；

8）用2倍体积的缓冲液D轻轻重悬线粒体沉淀，13000g×15min离心，得到线粒体粗提物，保存于4℃；

所述获取步骤均在4℃下进行。

4.根据权利要求3所述的构建培养方法，其特征在于，步骤（3）中，所述蔗糖密度梯度离心法获得酵母细胞纯化线粒体的步骤为：

1）用缓冲液E配制质量分数分别为60%，32%，23%，15%的蔗糖溶液；

2）超速离心管自下而上上样为1.5ml的60%蔗糖溶液，4ml的32%蔗糖溶液，1.5ml的23%蔗糖溶液，1.5ml的15%蔗糖溶液，4-6ml保存于缓冲液D中的线粒体粗提物；

3）2℃，140000g离心1-1.5h，轻轻取出离心管，在蔗糖浓度60%和32%的界面处，即为纯化的酵母细胞线粒体，取出；

4）用缓冲液D将纯化的线粒体重悬，2℃，10000g×10min离心，洗涤两次，保存于EP管中。

5.根据权利要求3或4所述的构建培养方法，其特征在于，所述乳腺肿瘤细胞的细胞培养基为DMEM培养基；所述缓冲液A为：12.114g的Tris-Base，硫酸调pH到9.4,2.5ml的4M的DTT溶液，加水定容至1L；所述缓冲液B为：218.604g的山梨糖醇，13.954g的K₂HPO₄，2.692g的KH₂PO₄，加水定容至1L；所述缓冲液C为：50ml的100mM的Tris-HCL，54.8g的山梨糖醇，1ml的0.5M的EDTA，5ml的0.1M的PMSF，1g的BSA，加水444ml；所述缓冲液D为：4.5543g的蔗糖，10ml的0.1M的Mops，10ml的10mM的EDTA，加80ml的水；所述缓冲液E为:10ml的0.1M的Mops，10ml的10mM的EDTA，加80ml的水。

6.根据权利要求1-5任一项所述的构建培养方法，其特征在于，所述MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞在培养液中进行贴壁培养，待细胞生长至50-80%即可。