[发明专利]一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用

权利要求书

1.一种重组质粒pRed02-Gm^r，其特征在于，核苷酸序列为如SEQ ID No.37所示序列。

2.一种对丁香假单胞菌进行基因敲除的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的重组质粒对丁香假单胞菌进行Psyr_1621基因全基因敲除，所述丁香假单胞菌为丁香假单胞菌丁香致病变种B728a(Pseudomonassyringaepv.syringaeB728a，PssB728a)；

所述方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的重组质粒通过电击转化导入所述丁香假单胞菌中，得到含有权利要求1所述的重组质粒pRed02-Gm^r的重组子PssB728a/pRed02-Gm^r；

(2)以丁香假单胞菌丁香致病变种B728a总DNA为模板，利用引物F1和R1，PCR扩增得到Psyr_1621基因的上游片段；

以丁香假单胞菌丁香致病变种B728a总DNA为模板，利用引物F2和R2，PCR扩增得到Psyr_1621基因的下游片段；

以pKD4质粒为模板，利用引物F3和R3，PCR扩增得到FRT-Kan^r-FRT片段；

将PCR扩增获得的Psyr_1621基因的上游和下游片段以及FRT-Kan^r-FRT片段共同作为模板，通过重叠PCR方法，使Psyr_1621基因的上游片段、FRT-Kan^r-FRT片段和Psyr_1621基因的下游片段搭桥成一个大片段；用Ω-PCR的方法将所述大片段和pSRK-Gm^r质粒反应，转化后通过筛选和测序鉴定，获得用于Psyr_1621基因敲除的敲除盒片段克隆载体pSRK-1621-Kan^r；

所述pSRK-1621-Kan^r的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示；

所述F1的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述R1的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

所述F2的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；所述R2的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

所述F3的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；所述R3的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；

(3)以步骤(2)得到的pSRK-1621-Kan^r作为模板，分别以1621-500F/R和1621-250F/R作为引物，分别PCR扩增得到带有500bp和250bp同源臂的卡那霉素抗性基因，将PCR扩增产物电击转化至步骤(1)得到的PssB728a/pRed02-Gm^r中，经过验证后得到Psyr_1621全基因敲除的丁香假单胞菌；

所述1621-500F的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示；所述1621-500R的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；

所述1621-250F的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示；所述1621-250R的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示。

3.一种对丁香假单胞菌进行基因敲除的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的重组质粒对丁香假单胞菌进行Psyr_3467基因的N端600bp敲除，保留330bp；所述丁香假单胞菌为丁香假单胞菌丁香致病变种B728a(Pseudomonassyringaepv.syringaeB728a，PssB728a)；

所述方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的重组质粒pRed02-Gm^r通过电击转化导入所述丁香假单胞菌中，得到含有权利要求1所述的重组质粒的重组子PssB728a/pRed02-Gm^r；

(2)以丁香假单胞菌丁香致病变种B728a总DNA为模板，利用引物F4和R4，PCR扩增得到Psyr_3467基因的上游片段；

以丁香假单胞菌丁香致病变种B728a总DNA为模板，利用引物F5和R5，PCR扩增得到Psyr_3467基因的下游片段；

将Psyr_3467基因的上游和下游片段进行酶切连接至pMD19-T载体，得到重组质粒pMD19-T-3467-up-dn；

以pHSG399-FRT-Kan^r-FRT质粒为模板，利用引物F6和R6，PCR扩增得到FRT-Kan^r-FRT片段，再将所述FRT-Kan^r-FRT片段与所述重组质粒pMD19-T-3467-up-dn酶切连接，再经转化及菌落PCR筛选，获得用于Psyr_3467基因敲除的敲除盒片段克隆载体pMD19-3467-Kan^r；

所述pMD19-3467-Kan^r的核苷酸序列如SEQ ID No.39所示；

所述F4的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；所述R4的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；

所述F5的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；所述R5的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；

所述F6的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；所述R6的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；

所述pHSG399-FRT-Kan^r-FRT质粒是以pUC18-Mini-Tn7T-Gm质粒为模板，FRTGmEcoRI F和FRTGmHindIIIR为引物，扩增得到FRT-Gm^r-FRTcassette片段，之后连接至pHSG399质粒构建得到；

所述FRTGmEcoRIF的核苷酸序列如SEQ ID No.42所示；所述FRTGmHindIIIR的核苷酸序列如SEQ ID No.43所示；

(3)以步骤(2)得到的pMD19-3467-Kan^r作为模板，利用引物3467-750F/R，PCR扩增带有750bp同源臂的卡那霉素抗性基因，将PCR扩增产物电击转化至步骤(1)得到的Pss B728a/pRed02-Gm^r中，经过验证后得到Psyr_3467部分基因敲除的丁香假单胞菌；

所述3467-750F的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示；所述3467-750R的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示。