[发明专利]一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用

说明书

本发明公开了一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用，涉及基因工程技术领域；该重组系统的核苷酸序列为如SEQ ID No.37所示序列，其中该重组系统携带庆大霉素基因、阿拉伯糖调控基因和重组酶基因amp‑araC‑red、广宿主复制子pBBR1和蔗糖敏感负筛选基因sacB。该重组系统可以应用于丁香假单胞菌的基因重组中，能介导Psyr_1621的全基因敲除和Psyr_3467的5’端部分敲除，该重组系统不仅携带由阿拉伯糖诱导的λRed的重组酶蛋白，并且可以在蔗糖的筛选压力下将质粒丢失。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用。

背景技术

细菌基因组定点突变通常使用同源重组技术实现。该技术通过导入含有与基因组同源的外源DNA的自杀性质粒，与染色体上的目的基因进行交叉互换，进而在细菌自身DNA修复系统作用下实现外源DNA片段替代染色体上目的基因。该方法虽然可完成大多数细菌的基因编辑，但存在操作技术繁琐、耗时长、效率低等缺点。噬菌体编码的同源重组系统同样可以促进线性DNA分子与目标基因组的整合，基于噬菌体编码的重组系统对基因组DNA进行设计和改造，在大肠杆菌中已有应用。在携带Rac原噬菌体的大肠杆菌中，RecTE系统能促使短同源臂DNA分子进行同源重组；而λ噬菌体Red操纵子编码的Red系统在大肠杆菌中能够介导高效的同源重组。其中，Red操纵子编码的Exo、Beta、Gam蛋白分别是具有DNA单链5’端向3’端的切割活性的核酸外切酶、促进由Exo蛋白切割后裸露的3’末端互补退火的单链结合蛋白和能与RecBCD核酸外切酶结合并抑制体内的外源DNA降解的辅助蛋白。

丁香假单胞菌丁香致病变种B728a(Pseudomonas syringaepv.syringae B728a，Pss B728a)致病型多，病害范围广，引起植物病害的发生概率较高，能造成毁灭性植物灾害，给农业经济造成了巨大损失。为研发防治丁香假单胞菌的方法，有必要深入研究丁香假单胞菌及其基因功能。对基因功能研究的最重要方法之一是将被研究的基因敲除，构建相应的突变体；同源重组技术是丁香假单胞菌基因操作的传统技术，但该技术操作繁琐、耗时长、效率低。利用源于噬菌体的同源重组系统，在许多细菌中可以介导高效率重组。λRed和RecET重组系统可显著提高大肠杆菌和其他肠道菌群的短同源臂DNA重组效率；有文献报道在铜绿假单胞菌中，利用RecTE系统也可以促进重组发生。

除了同源重组酶，特异性重组酶也作为遗传操作的工具。由于位点特异性重组系统能有效克服常用的重组技术在基因重组方面难以避免的随机整合等不足之处，并且具有较高的重组效率，因此已广泛用于各种生物的基因操作。根据特异性重组酶的催化残基和序列同源性的不同，其主要分为酪氨酸家族和丝氨酸家族。其中，来源于酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)的FLP/FRT系统属于酪氨酸家族。FLP重组酶能特异性识别FRT位点，当两个FRT位点反向重复时，FLP能识别产生外源基因的倒置和插入作用；同向重复时，FLP能识别位点间的序列产生删除效应。利用这个特性，FLP/FRT系统可用于外源基因和选择标记基因的去除，并且能在基因组中融入短肽，使重组系统与特异性重组酶系统得以在丁香假单胞菌中结合运用。

发明内容

本发明的目的是提供一种丁香假单胞菌中的重组系统及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该重组系统可以应用于丁香假单胞菌的基因重组中，能介导Psyr_1621的全基因敲除和Psyr_3467的5’端部分敲除，该重组系统不仅携带由阿拉伯糖诱导的λRed的重组酶蛋白，并且可以在蔗糖的筛选压力下将质粒丢失。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种丁香假单胞菌中的重组系统，核苷酸序列为如SEQ ID No.37所示序列，其中所述重组系统携带庆大霉素基因、阿拉伯糖调控基因和重组酶基因amp-araC-red、广宿主复制子pBBR1和蔗糖敏感负筛选基因sacB。

本发明还提供上述丁香假单胞菌中的重组系统的构建方法，包括以下步骤：