[发明专利]一种CHO-S.attp重组细胞株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种CHO-S.attp重组细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建质粒：将attp位点序列和GFP报告基因构建到含有PCDNA3.3载体；

(2)培养CHO细胞；

(3)电穿孔转染，细胞计数、离心后弃掉上清；

(4)重悬细胞后，加入attp质粒至细胞悬液中，对细胞悬液进行电穿孔，然后转入摇床培养；

(5)FACS检测细胞转染效率，同时对细胞进行加压筛选；

(6)继续培养细胞至活性恢复，进行FACS检测；

(7)对筛选后的细胞池进行静置培养；

(8)挑选单克隆进行FACS检测，筛选后进行扩大培养和稳定性检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述CHO细胞为CHO-S细胞或者CHO-K1细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述细胞活率为95％以上，所述离心方式为800rpm离心5min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中选用5×10⁶细胞，所述步骤(4)中将10ug attp质粒加入所述细胞悬液中，所述5×10⁶细胞对应所述10ug质粒。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述对细胞进行加压筛选具体为：分别加入终浓度为10ug/ml，20ug/ml，30ug/ml的抗生素进行筛选。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述细胞活率恢复至90％时，进行FACS检测。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，所述静置培养的条件为37℃下，5％CO₂的培养箱中静置培养10-15天；所述筛选的方法为选择GFP阳性率最高的抗生素浓度筛选。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(8)中，所述筛选的方法为：选出阳性率高，峰型对称的阳性克隆。

9.采用权利要求1-8任一项所述方法构建的CHO-S.attp重组细胞株。

10.一种应用权利要求9所述的CHO-S.attp重组细胞株作为宿主细胞构建目的基因细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)质粒构建：将带有attB位点序列和目的蛋白基因构建到pcDNA5载体，Bxb1重组酶基因构建到POG44载体；

(2)培养CHO-S.attp细胞；

(3)电穿孔转染：细胞计数，离心后弃掉上清；

(4)重悬细胞，加入质粒至细胞悬液中，对细胞悬液进行电穿孔，然后细胞转入摇床进行培养；

(5)FACS检测细胞的转染效率，同时对细胞进行加压筛选，加入抗生素之后的每2-3天查看细胞生长情况，直至细胞活率恢复至90％，进行FACS检测。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，所述CHO-S.attp细胞活率为95％以上，取2×10⁶细胞以800rpm，5min离心。

12.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，所述质粒中目的基因质粒和Bxb1重组酶质粒的质量比例为1:9。

13.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述步骤(5)中，所述对细胞进行加压筛选的方式具体为：分别加入终浓度为500ug/ml，1000ug/ml的抗生素进行筛选。

14.一种对权利要求9所述的CHO-S.attp重组细胞株定点整合位点重组验证的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取CHO-S.attp细胞基因组；

(2)设计引物如下：

(3)进行PCR实验；

(4)胶回收目的片段，进行attp，attb重组位点测序。