[发明专利]一种CHO-S.attp重组细胞株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开一种CHO‑S.attp重组细胞株的构建方法和应用，构建方法主要包括以下步骤：将attp位点序列和GFP报告基因构建到含有PCDNA3.3载体，将带有attB位点序列和目的蛋白基因构建到pcDNA5载体，Bxb1重组酶基因构建到POG44载体；将所得的含有attp质粒转染CHO‑S细胞，抗生素筛选，FACS检测，获得CHO‑S.attp细胞池；利用所得细胞池，进行有限稀释，加压筛选单克隆，通过FACS检测，获得CHO‑S.attp细胞株；将attb和目的基因质粒与Bxb1重组酶共转染CHO‑S.attp细胞株，加压筛选，FACS检测，获得阳性率高，表达量高，稳定性好的细胞系。本发明具有耗时短，表达量高，阳性率高，稳定性好等优点，可直接用于抗体筛选，并可以提高抗体筛选的质量，加速后续的抗体体外研发进程。

技术领域

本发明涉及质粒构建、细胞系构建领域，尤其涉及一种CHO-S.attp重组细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

CHO细胞作为宿主细胞构建细胞系一直是新药临床前筛选和研究的重要工具。目前细胞系的构建多数采用目的基因随机整合到细胞基因组中的方法，此方法构建过程比较繁琐，周期较长。为了继续推动生物药物产品的开发，提高细胞系开发过程的效率至关重要。

利用噬菌体Bxb1特异性位点重组酶系统进行细胞系构建，可大大减少细胞系开发时间。先利用随机整合的方法把定点整合的位点attP随机整合到CHO-S细胞基因组中，通过抗生素筛选，获得CHO-S.attP重组细胞模型，以CHO-S.attp重组细胞株作为宿主细胞，借助Bxb1重组酶，将带有attB位点和目的蛋白基因的DNA定点整合到CHO-S.attp细胞株中，经抗生素加压筛选，实现目的蛋白的稳定高表达。

attP、attB是一对位点特异性重组序列，并共同含有一段核心序列，Bxb1重组酶可以识别核心序列进行剪切，attP、attB发生重组后会形成新的序列attL、attR，且发生重组后反向剪切需要IHF(integration host factor)，因此attP、attB位点特异性重组是定向的，不可逆的。

中国发明专利(授权公告号CN 100381573 C)公开了一种基因组中含有可扩增的高转录活性位点的细胞株的构建方法，用整合标记载体，将标记插入哺乳动物基因组可扩增性的转录活性位点，接着用靶向表达载体和重组酶表达载体双质粒共转染哺乳动物细胞，使目标基因在位点特异性重组系统的作用下整合至基因组的标记处，通过扩增基因的扩增作用，快速增加基因拷贝数，实现基因高表达。其中应用重组酶识别和切割一对重组信号序列，例如AttP、AttB，选择细胞株为CHO-dhfr^-。该专利与本发明的不同之处在于，本发明使用CHO-S细胞株，借助Bxb1重组酶，将带有attB位点和目的蛋白基因的DNA定点整合到CHO-S.attp细胞株中，与该对比文件中的细胞株构建方法不同。

中国发明专利(申请公布号CN 113136400 A)公开了一种高效表达外源蛋白的CHO细胞株的构建方法及其应用，方法包括在外援蛋白序列N端添加信号肽序列，将添加信号肽序列的外援蛋白与Fc融合连接，构建表达质粒，用表达质粒转染CHO细胞，收获外源蛋白。该发明与本发明的不同之处在于，该发明所述方法得到的产物主要应用于制备疫苗组合物，该方法主要用于提高CHO表达外源蛋白的表达量，主要采用在蛋白序列端添加信号肽的方式，获得的产物是一种分泌型蛋白。本发明构建CHO-S.attp靶蛋白细胞系产物是一种膜蛋白，用于新药研发筛选，从细胞株的构建方法和用途两者均有不同。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明要解决的技术问题之一是提供一种CHO-S.attp重组细胞株的构建方法，与传统构建细胞系方法相比较，本发明方法具有耗时短，表达量高，阳性率高，稳定性好等优点，可直接用于抗体筛选，并可以提高抗体筛选的质量，加速后续的抗体体外研发进程，同时推进抗体药物研发阶段项目进度。