[发明专利]一种家蚕shRNA表达载体构建方法及应用

权利要求书

1.一种家蚕shRNA表达载体构建方法，其特征在于：采用家蚕RNA聚合酶U6启动子，并对该启动子的两端分别引入gtatcttatcatgtctggat和ggtaccaagctttaaattcg重组位点，通过PCR扩增将pIZT/V5-His载体线性化后重组置换载体上的OpIE2启动子。

2.根据权利要求1所述的一种家蚕shRNA表达载体构建方法，其特征在于：仅需体外合成一对互补的单长链DNA，两端选择KpnI和EcoRI作为酶切位点，通过高温孵育3分钟后退火形成含有黏性末端的长双链DNA片段，将KpnI和EcoRI双酶切后的载体和双链DNA通过T4DNA连接酶连接，克隆转化大肠杆菌后菌P验证，挑选正确的克隆进行测序验证。

3.根据权利要求1所述的一种家蚕shRNA表达载体构建方法，其特征在于：体外合成两条单链DNA，通过稀释片段后体外退火形成具有黏性末端的长双链DNA片段。

4.根据权利要求1所述的一种家蚕shRNA表达载体构建方法，其特征在于：退火形成长链DNA片段末端为黏性末端，突出的末端为4个碱基，分别为GTAC和TTAA。

5.根据权利要求1所述的一种家蚕shRNA表达载体构建方法，其特征在于：体外合成的单长链由21nt的发夹结构和6nt的茎环结构组成，6nt的茎环结构由CTCGAG序列组成。

6.根据权利要求1所述的一种家蚕shRNA表达载体构建方法，其特征在于：退火后形成的DNA片段能够和权力要求书1中构建的载体双酶切之后的黏性末端进行连接。

7.根据权利要求1所述的一种家蚕shRNA表达载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、运用CE DesignV1.04软件设计基因特异性重组引物，该引物末端含有gtatcttatcatgtctggat和ggtaccaagctttaaattcg重组位点；

S2、克隆BmU6启动子的具体方法为：以家蚕卵巢组织基因组DNA为模板，通过PCR技术扩增家蚕BmU6启动子，反应条件：95℃预变性5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s(循环30次)；72℃延伸10min。反应体系：2X Mix：10μL；引物-F：1μL；引物-R：1μL；DNA模板：1μL；ddH2O：补齐至20μL。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收纯化；

S3、pIZT/V5-His载体线性化的具体方法为：以pIZT/V5-His载体为模板，通过PCR技术扩增将其线性化，正向引物pIZT-V5-F(CGAATTTAAAGCTTGGTACCGAG)，反向引物pIZT-V5-R(ATCCAGACATGATAAGATACATTGATGA)，反应条件：95℃预变性5min；95℃1min30s，58℃2min，72℃2min(循环30次)；72℃延伸10min。反应体系：2X Mix：10μL；引物-F：1μL；引物-R：1μL；DNA模板：1μL；ddH2O：补齐至20μL，将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收纯化；

S4、pIZT/V5-His-BmU6载体重组的具体方法为：将S2和S3回收的片段计算浓度后按照载体：目的片段＝67:20的比例计算重组反应体系，反应条件：37℃重组40min，反应体系：5Xbuffer：2μL；重组酶：0.5μL；pIZT/V5-His线性化载体：3.5μL；BmU6目的片段：4μL；

S5、pIZT/V5-His-BmU6载体验证的具体方法为：将S4的重组体系转化100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，反应条件：冰浴30min；42℃水浴热激90s，立即冰浴5min，加入800μL LB无抗液体培养基，37℃孵育1h；适当体积的转化细胞均匀涂在含有相应博来霉素的LB固体平板培养基上，37℃倒置培养18h后挑选单菌落进行菌落PCR验证，阳性克隆测序验证；

S6、目的基因shRNA载体构建的具体方法为：通过在线软件设计目的基因的shRNA靶点信息，体外合成针对靶点序列的由21nt的发夹结构和6nt环形结构组成的单长链，6nt的茎环结构由CTCGAG序列组成，通过合成正义链和反义链，合成的正义链和反义链通过体外加热变性后自然冷却降温复性形成双链结构，反应体系：正义链(1μL)；反义链(1μL)；退火Buffer(8μL)；水(10μL)。反应结束后加入80μL水，将退火产物稀释5倍，反应条件：水浴锅升温至100℃后将反应体系保温3min，关闭水浴锅，自然冷却降温，约3h，降温至30℃左右即完成退火；

S7、退火形成的长双链DNA片段末端为黏性末端，突出的末端为4个碱基，分别为GTAC和TTAA，退火形成的长双链DNA和通过KpnI和EcoRI双酶切的pIZT/V5-His-BmU6载体连接形成目的基因的shRNA干扰载体，酶切体系：KpnI和EcoRI各1μL，10X buffer：2μL，pIZT/V5-His-BmU6载体模板1μL，ddH2O：补齐至20μL，37℃孵育20min，连接体系：T4 DNA ligase：0.5μL；T4 DNA Buffer：1μL；KpnI和EcoRI双酶切的pIZT/V5-His-BmU6载体：1.5μL；退火稀释片段：1μL；ddH2O：补齐至10μL，22℃连接1h；

S8、目的基因shRNA载体验证的具体方法为：将S7的连接体系转化100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，反应条件：冰浴30min；42℃水浴热激90s，立即冰浴5min，加入800μL LB无抗液体培养基，37℃孵育1h；适当体积的转化细胞均匀涂在含有相应博来霉素的LB固体平板培养基上，37℃倒置培养18h后挑选单菌落进行菌落PCR验证，阳性克隆测序验证。