[发明专利]一种家蚕shRNA表达载体构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种家蚕shRNA表达载体构建方法，采用家蚕RNA聚合酶U6启动子，并对该启动子的两端分别引入gtatcttatcatgtctggat和ggtaccaagctttaaattcg重组位点，通过PCR扩增将pIZT/V5‑His载体线性化后重组置换载体上的OpIE2启动子。该家蚕shRNA表达载体构建方法，通过重组法将骨架载体pIZT/V5‑His中的启动子OpIE2重组替换为家蚕中的U6启动子BmU6，不受酶切位点的限制，而且重组效率很高。

技术领域

本发明涉及昆虫基因技术领域，具体为一种家蚕shRNA表达载体构建方法及应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，缩写为RNAi)是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达，当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。

RNAi技术目前已广泛应用于动植物的基因功能研究中，结合基因组测序技术的大量数据，可以快速高效的进行特异性的基因功能分析，通过外源合成dsRNA或shRNA转入细胞，利用细胞内的RNAase将其切割成siRNA而发挥调控降解靶基因的作用，与直接合成siRNA相比，dsRNA更稳定，发挥作用的时间更长，也可进一步筛选构建稳转细胞系。

家蚕是鳞翅目的模式物种，有独特的性别决定方式及细胞周期调控方式。家蚕中大约有15000个基因，其中大部分功能未知，利用家蚕细胞系进行基因功能验证时普遍存在转染效率低，敲减效率低等诸多问题，限制了家蚕基因功能研究的进展，通过将线虫的dsRNA跨膜通道蛋白SID转入家蚕细胞可以大大提高敲减效率，但是依然存在实验操作复杂、干扰效果是瞬时等弊端。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种家蚕shRNA表达载体构建方法及应用，通过将昆虫表达载体pIZT/V5-His中的OpIE2启动子重组替换为BmU6启动子，可以实现快速高效的shRNA克隆表达，具有低成本、高效率的特点。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种家蚕shRNA表达载体构建方法，采用家蚕RNA聚合酶U6启动子，并对该启动子的两端分别引入gtatcttatcatgtctggat和ggtaccaagctttaaattcg重组位点，通过PCR扩增将pIZT/V5-His载体线性化后重组置换载体上的OpIE2启动子。

优选的，仅需体外合成一对互补的单长链DNA，两端选择KpnI和EcoRI作为酶切位点，通过高温孵育3分钟后退火形成含有黏性末端的长双链DNA片段，将KpnI和EcoRI双酶切后的载体和双链DNA通过T4 DNA连接酶连接，克隆转化大肠杆菌后菌P验证，挑选正确的克隆进行测序验证。

优选的，体外合成两条单链DNA，通过稀释片段后体外退火形成具有黏性末端的长双链DNA片段。

优选的，退火形成长链DNA片段末端为黏性末端，突出的末端为4个碱基，分别为GTAC和TTAA。

优选的，体外合成的单长链由21nt的发夹结构和6nt的茎环结构组成，6nt的茎环结构由CTCGAG序列组成。

优选的，退火后形成的DNA片段能够和权力要求书1中构建的载体双酶切之后的黏性末端进行连接。

为配合上述家蚕shRNA表达载体构建方法，现提供以下实验步骤：S1、运用CEDesignV1.04软件设计基因特异性重组引物，该引物末端含有gtatcttatcatgtctggat和ggtaccaagctttaaattcg重组位点；