[发明专利]一种检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒及检测卡

权利要求书

1.一种检测侵染当归的苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒，其特征在于，其包括苜蓿花叶病毒的检测卡和检测苜蓿花叶病毒的RT-LAMP检测引物组合物，所述检测引物组合物包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ IDNO.3所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP和SEQ ID NO.5所示的反向环引物LB；

所述检测卡包括在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述胶体金结合垫上含有胶体金-苜蓿花叶病毒抗体的结合物，所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，所述检测T线包被有AMV的抗体IgG，所述质控C线包被有抗AMV抗体的二抗；所述检测T线上AMV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；所述抗AMV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白；

所述胶体金结合垫上的苜蓿花叶病毒抗体的包被量为每毫升胶体金中含13-14μg的苜蓿花叶病毒抗体。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测卡还包括由下壳体和上壳体组成的卡槽，所述衬板与所述下壳体的一个端面固定连接，所述上壳体与所述下壳体固定连接，且所述上壳体与所述下壳体留有放置所述衬板的安装腔。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述上壳体上间隔设置有加样窗和反应观察窗，所述加样窗空间上位于所述样品垫的上方，所述反应观察窗空间上位于所述硝酸纤维素膜的上方。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述上壳体与所述下壳体通过卡扣结构卡接。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-LAMP扩增反应试剂，所述RT-LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、ThermoPol反应缓冲液、MgSO₄、DNA聚合酶和水。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为水，所述阳性对照品为苜蓿花叶病毒外壳蛋白CP基因片段标准品。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录酶选自AMV反转录酶或M-MLV反转录酶；

所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶。

9.一种采用如权利要求1-8任一项所述的试剂盒检测侵染当归的苜蓿花叶病毒的检测方法，其特征在于，其包括：

(1)取待测溶液置于苜蓿花叶病毒的检测卡的样品垫上，观察检测T线和质控C线的颜色变化，初次判断待测样品中是否含有苜蓿花叶病毒AMV；

(2)若根据步骤(1)无法鉴别待测样品中是否含有苜蓿花叶病毒AMV，进行反转录RT-LAMP扩增：将步骤(1)免疫富集反应后检测卡上的检测T线取下，以取下的检测T线作为模板，利用RT-LAMP检测引物组进行RT-LAMP扩增；根据RT-LAMP扩增反应产物二次判断待测样品中是否含有苜蓿花叶病毒。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，根据检测T线和质控C线的颜色变化初次判断待测样品是否含有AMV的具体方法为肉眼观察法；所述肉眼观察法为：

若检测T线和质控C线上均出现棕红色的条带时，说明待测样品中含有苜蓿花叶病毒AMV，无需进行反转录RT-LAMP扩增；

若检测T线没有颜色变化而仅质控C线出现棕红色的条带时，则判定被检样品没有感染苜蓿花叶病毒AMV，或感染苜蓿花叶病毒AMV的含量低，则需进行反转录RT-LAMP扩增。