[发明专利]一种检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒及检测卡

说明书

本发明公开了一种检测苜蓿花叶病毒的GICA‑RT‑LAMP试剂盒及检测卡，涉及苜蓿花叶病毒检测技术领域。本发明将胶体金免疫层析和核酸检测方法有机地结合起来，具有操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快、成本低的技术优势。可以在恒温水浴中完成扩增反应，检测结果可用肉眼直接判断，既适用于AMV病毒病的田间或现场快速筛查，也适用于实时精确监控，将为AMV病毒的种子质量监测、田间防治、海关检验、检疫提供可靠的技术支撑。

技术领域

本发明涉及苜蓿花叶病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒及检测卡。

背景技术

当归(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)，是一种大宗名贵中药材，为伞形科多年生草本植物，又名岷当归、干归、马尾当归、西当归等。在我国，当归主要种植于甘肃、云南、贵州、四川、湖北、青海等省，特别是甘肃省岷县当归种植历史悠久，品质极佳，产量第一，素有“中国当归之乡”和“千里药乡”之称。

而随着人工种植规模和地域的不断扩大及连年种植，当归种源退化，种子质量下降，原产地病害频发，尤其连作障碍引发的细菌、真菌和病毒病害连年发生，日趋严重，药材产量大幅减少，品质下降。

目前，关于当归病害的研究，主要集中在真菌病害上，病毒病鲜见报道。实际上病毒病也是一种极为严重的植物病害，防治困难，素有“植物癌症”之称。植物感染病毒后，种性退化，抗性减弱，更易受到真菌、细菌等其他病原物的侵害，田间往往多种病害复合发生，造成更为严重的损失。发明人2019年对甘肃省当归主产区(岷县、宕昌、漳县、渭源和榆中)病毒病害做了初步的调查和检测，在68份田间呈现病毒样症状的样品中，53份检测出了病毒感染，病毒感染率高达79％。除此之外，在部分样品中利用小RNA测序技术(small RNAsequencing， sRNA-seq)还鉴定到了苜蓿花叶病毒(Alfafa mosaic virus,AMV)，这是当归作物中首次发现有AMV感染。当归感染AMV等病毒后，植株矮化，叶片出现花叶，斑驳，黄化和坏死斑等症状，产量减少，品质降低，严重影响了药材质量。

目前，针对AMV病毒的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等，但这些方法都还停留在研究和实验室阶段，表现在程序复杂，检测费用高、对仪器设备和检测条件要求高，需要长期经验积累和具有专业操作技能的人员才能完成，因此使用范围受到很大的局限，无法满足当归种植现场及田间快速检测的需求。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测苜蓿花叶病毒的GICA-RT-LAMP试剂盒及检测卡以解决上述技术问题。

现有的ELISA及其衍生技术受灵敏性的限制易出现假阴性结果，而逆转录聚合酶链式反应及其衍生技术检测有存在RNA提取难度大，准确性无法得到保障，急需开发出适用于种子病毒病害快速、灵敏检测的新技术和新方法。

发明人将胶体金免疫层析检测GICA与LAMP技术有机结合，先通过胶体金免疫层析GICA技术富集待测样本中的病毒粒子，快速筛查并判断样本中的病毒感染情况；接着利用富集到的病毒粒子作为模板，进行反转录RT和DNA环介导等温LAMP扩增，扩增产物用肉眼观察，精确判断样本中的病毒感染情况，以此成功建立了GICA-RT-LAMP技术特异性检测苜蓿花叶病毒AMV的方法。

本发明是这样实现的：

AMV是雀麦花叶病毒科(Bromovirus)苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)的重要成员。AMV的寄主十分广泛，可以侵染51科双子叶植物的430多种，如苜蓿、番茄、大豆、烟草和马铃薯等，AMV主要通过汁液摩擦和多种蚜虫以非持久方式进行传播。