[发明专利]一种重组火鸡疱疹病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，在火鸡疱疹病毒基因组的HVT005区和HVT006区之间的间隔区中插入外源基因，所述外源基因选自来自鸡新城疫病毒、禽流感病毒或禽传染性囊病病毒的基因，或鸡的其他疫病病原保护性基因；

优选地，所述禽流感病毒选自H9N2亚型禽流感病毒、H5N1亚型禽流感病毒、H7N7亚型禽流感病毒、H5N2亚型禽流感病毒、H7N2亚型禽流感病毒、H9N1亚型禽流感病毒；所述新城疫病毒选自VII型鸡新城疫病毒、II型鸡新城疫病毒、III型鸡新城疫病毒；

更优选地，所述外源基因选自鸡新城疫病毒F基因、禽流感病毒的HA基因、禽传染性囊病病毒的VP2基因。

2.根据权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述火鸡疱疹病毒基因组的HVT005区和HVT006区之间的间隔区为火鸡疱疹病毒8867nt-9319nt之间，优选地，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

3.根据权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述鸡新城疫病毒F基因为VII型鸡新城疫病毒F基因完整的开放阅读框，其裂解位点更换成鸡新城疫活疫苗(La Sota株)的裂解位点；

优选地，鸡新城疫病毒F基因核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

更优选地，所述鸡新城疫病毒F基因的表达盒由mCMV启动子、鸡新城疫病毒F基因和SV40 poly A依次连接而成。

4.根据权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述的禽流感病毒的HA基因为H9N2亚型禽流感病毒HA基因完整的开放阅读框；

优选地，H9N2亚型禽流感病毒HA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3；

更优选地，H9N2亚型禽流感病毒HA基因的表达盒由mCMV启动子、外源基因和SV40polyA依次连接而成。

5.权利要求1-4任一项所述的重组火鸡疱疹病毒的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：

S1)构建CRISPR-Cas9质粒：

S1-1)针对HVT005区和HVT006区之间的间隔区设计sgRNA序列，sgRNA序列如SEQ IDNO.7所示，TCATATACTGAATCGTAGGG SEQ ID NO.7；

S1-2)根据设计的sgRNA序列合成正链HVT005/006-sgRNA-F和负链HVT005/006-sgRNA-R，退火形成dsDNA后插入载体中获得CRISPR-Cas9质粒；

正链HVT005/006-sgRNA-F和负链HVT005/006-sgRNA-R序列如下SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示；

S2)构建供体载体质粒，所述供体载体质粒中包含外源基因表达盒；

S3)构建重组火鸡疱疹病毒和纯化：pX459-sgA质粒、CRISPR-Cas9质粒和供体载体质粒共转染于原代鸡胚成纤维细胞中，然后接种火鸡疱疹病毒，培养至细胞病变；纯化得到初级重组火鸡疱疹病毒；

S4)去除步骤S3)所得初级重组火鸡疱疹病毒中的GFP，获得重组火鸡疱疹病毒。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S2)包括以下步骤：

S2-1)将外源基因插入pcDNA3.1-SfiI载体中，获得pcDNA3.1-SfiI-外源基因载体；

S2-2)将pcDNA3.1-SfiI-外源基因载体中的外源基因表达盒通过SfiI酶切位点连入pT-sgA-GFP载体中，获得pT-sgA-GFP-外源基因载体。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S4)包括以下步骤：pcDNA3.1-Cre质粒转染于原代鸡胚成纤维细胞中，接种步骤S3)所得初级重组火鸡疱疹病毒，培养至细胞病变，经过病毒挑斑纯化，得到重组病毒rHVT-外源基因。

8.权利要求1至4任一所述重组火鸡疱疹病毒在制备用于预防禽流感和/或鸡新城疫和/或禽传染性囊病的疫苗中的应用。