[发明专利]一种重组火鸡疱疹病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种重组火鸡疱疹病毒及其制备方法和应用，具体提供了一种重组火鸡疱疹病毒，在火鸡疱疹病毒基因组的HVT005区和HVT006区之间的间隔区中插入外源基因，所述外源基因选自来自鸡新城疫病毒、禽流感病毒或禽传染性囊病病毒的基因；所述火鸡疱疹病毒基因组的HVT005区和HVT006区之间的间隔区为火鸡疱疹基因组的8867nt‑9319nt之间，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明首次发现HVT005‑HVT006间隔区可作HVT外源基因插入的位点。利用CRISPR/Cas9技术在HVT基因组HVT005‑HVT006间隔区插入外源基因，可作为鸡新城疫预防和禽流感预防的疫苗候选株。

技术领域

本发明属于基因工程疫苗技术领域，具体涉及利用CRISPR-Cas9技术构建重组火鸡疱疹病毒株，重组病毒可以作为疫苗提供良好的保护作用。

背景技术

CRISPR-Cas9系统作为最近兴起的基因编辑技术，除了在高效产生基因工程细胞和动物模型的方面取得了巨大的成功，还被用于编辑多种大型DNA病毒的基因组，包括单纯疱疹病毒、腺病毒、伪狂犬病毒、痘病毒、豚鼠巨细胞病毒和鸭肠炎病毒。

火鸡疱疹病毒(HVT)已经广泛用作表达多种禽病异源抗原的疫苗载体，这些疫苗对马立克氏病病毒(MDV)和插入载体中的基因所属病毒提供了良好和持久的免疫效果。然而这些重组HVT疫苗主要产生于病毒感染细胞中的常规同源重组，或者通过在克隆全长基因组的细菌人工染色体(BAC)中的重组生成，这些方法产生重组病毒的效率较低，因此使用这些方法产生重组疫苗十分耗时。而利用CRISPR-Cas9系统可以高效编辑禽疱疹病毒基因组，快速产生重组病毒，具有广阔的技术应用前景。

HVT可供外源基因插入的位点目前已报道的有US2、US10、UL45/46、HVT065/066、TK等，发现新的HVT表达外源基因的位点，并基于现有插入位点构建插入多种外源基因的HVT活载体疫苗，可以实现一苗多防，具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的是提供一个火鸡疱疹病毒插入外源基因的位点HVT005/HVT006。

本发明一个方面提供了一种重组火鸡疱疹病毒，在火鸡疱疹病毒基因组的HVT005区和HVT006区之间的间隔区中插入外源基因，所述外源基因选自来自鸡新城疫病毒、禽流感病毒或禽传染性囊病病毒的基因；

进一步地，所述禽流感病毒选自H9N2亚型禽流感病毒、H5N1亚型禽流感病毒、H7N7亚型禽流感病毒、H5N2亚型禽流感病毒、H7N2亚型禽流感病毒、H9N1亚型禽流感病毒；所述新城疫病毒选自VII型鸡新城疫病毒、II型鸡新城疫病毒、III型鸡新城疫病毒；

进一步地，所述外源基因选自鸡新城疫病毒F基因、禽流感病毒的HA基因、禽传染性囊病病毒的VP2基因。

进一步地，所述火鸡疱疹病毒基因组的HVT005区和HVT006区之间的间隔区为火鸡疱疹病毒8867nt-9319nt之间，优选地，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

进一步地，所述鸡新城疫病毒F基因为VII型鸡新城疫病毒F基因完整的开放阅读框，其裂解位点更换成鸡新城疫活疫苗(La Sota株)的裂解位点。

进一步地，鸡新城疫病毒F基因核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

进一步地，所述鸡新城疫病毒F基因的表达盒由mCMV启动子、鸡新城疫病毒F基因和SV40 poly A依次连接而成。

进一步地，所述的禽流感病毒的HA基因为H9N2亚型禽流感病毒HA基因完整的开放阅读框。

进一步地，H9N2亚型禽流感病毒HA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

进一步地，H9N2亚型禽流感病毒HA基因的表达盒由mCMV启动子、外源基因和SV40poly A依次连接而成。