[发明专利]施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在介导同源重组上的应用

说明书

本发明涉及施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI‑RE蛋白在介导同源重组上的应用。本发明研究发现所述施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI‑RE蛋白影响DNA复制以及DNA损伤修复途径；本发明公开了施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI‑RE蛋白介导的大肠杆菌基因敲除技术的构建和应用。本发明首先构建施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI‑RE蛋白表达质粒和带有待敲除把基因序列左右同源臂序列的重组质粒；随后用两个质粒转化大肠杆菌，诱导双交换重组，通过表型筛选或PCR鉴定获得敲除靶基因的菌株。该操作系统首次构建基于PsPIWI‑RE蛋白与同源序列的基因编辑系统。为大肠杆菌等微生物的基因编辑提供新的优良工具。

技术领域

本发明涉及原核生物基因编辑技术领域，尤其是涉及施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白在介导同源重组上的应用。

背景技术

基因编辑技术是对细胞的基因组DNA序列进行插入、删除、替换等修改的一种技术。该技术可以实现基因组DNA的可遗传修改，使得目标细胞产生特定基因的敲除或敲入。该技术对基因工程、农业发展、生物医学研究、基因治疗等领域具有重要意义。目前较为成熟的基因编辑技术包括：ZFN技术，TALEN技术，CRISPR技术等，其中CRISPR技术作为新兴基因编辑技术，因其操作简便、成本低、脱靶率低等优势而受到广泛关注。2020年，EmmanuelleCharpentier和Jennifer A.Doudna两位科学家因在CRISPR技术的研究与突出贡献被授予2020年诺贝尔化学奖。

尽管CRISPR/Cas9技术相对成熟，但是仍然存在一些技术缺陷需要完善。CRISPR/Cas9技术的主要不足包括：脱靶效应，也就是存在对非靶标基因的编辑。虽然基于CRISPR/Cas9的改良技术可以降低脱靶率，但仍然无法完全解决脱靶问题；效率问题，CRISPR/Cas9对靶标基因的编辑效率取决于sgRNA和Cas9的浓度，浓度低则效率低，浓度高效率会提高，但是脱靶率会提高，因此，高效率和低脱靶率之间不可兼得；递送问题，Cas9蛋白分子量约160kDa，编码CRISPR-Cas9系统的DNA片段约为8–10kb，如此大分子量的DNA片段或蛋白质递送到目标细胞内是一个难题；免疫排斥，CRISPR/Cas9系统中的Cas9蛋白来源于原核生物，进入人体细胞会引起免疫排斥，存在安全性问题；副作用，运用CRISPR/Cas9进行基因治疗，存在一定副作用。

已有的基因编辑系统的不足，使得开发新型基因编辑系统的必要性和重要意义。近年来，有研究报道了基于Argonaute蛋白(Ago)的基因编辑系统。Argonaute蛋白编码基因广泛存在于真核、原核和古菌基因组中。研究表明，原核来源的Argonaute蛋白(pAgo)结合短链ssDNA(指导链，gDNA)特异性结合与gDNA互补配对的单链DNA底物。这种DNA引导的DNA剪切活性被认为具有开发为新型基因编辑工具的潜力。近期对NgAgo基因编辑能力的研究显示，NgAgo通过结合重组酶A(recA)参与微生物同源重组过程，提高同源重组效率和同源重组相关的基因编辑。NgAgo可以提高Pasteurella multocida和Escherichia coli中基因的插入或缺失效率到80-100％。NgAgo提高同源重组效率需要同源臂的存在，而gDNA的存在对同源重组效率的提高影响不大。分析认为，NgAgo通过结合recA，提高了recA介导的DNA链交换。以上结果表明，Ago蛋白参与了体内同源重组过程，设计Ago蛋白结合同源臂序列可以在微生物细胞内实现基因编辑或插入。这些结果为开发基于Ago蛋白的基因编辑工具提供了有力的理论依据。

Ago蛋白属于PIWI蛋白家族，对Ago蛋白同源序列进行同源性分析发现了几类PIWI家族远缘蛋白家族，其中一种远缘家族称为PIWI-RE家族。PIWI-RE家族的主要特点是，N端不具有典型的N端结构域和PAZ结构域。C端包含两个十分保守氨基酸残基：精氨酸(R)、谷氨酸(E)。作为不具有完整Ago结构域的PIWI家族蛋白，PIWI-RE蛋白的功能尚未见报道。

发明内容

基于现有技术的现状，本发明提供一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE蛋白及其应用。