[发明专利]一种以TTC作为神经元细胞靶向基因的融合蛋白的诱导表达

说明书

本发明提供了一种以TTC作为神经元细胞靶向基因的融合蛋白的诱导表达，属于生物医药技术领域。一、将线粒体外膜蛋白FUNDC1、破伤风杆菌重链C端无毒片段TTC和绿色荧光蛋白EGFP的碱基序列分别设计相应的引物，然后分别进行PCR扩增；二、回收步骤一的三个片段的基因后，将其与携带HIS(6×his)标签的PET‑32a(+)表达载体相连接，然后转化大肠杆菌DH5α；三、通过阳性克隆筛选，抽提质粒测序；四、将测序正确的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达纯化，得到高浓度较的TTC‑mFundc1‑EGFP融合蛋白；利用TTC‑mFundc1‑EGFP融合蛋白中破伤风无毒C端片段TTC的神经侵袭性，用于靶向到神经细胞。本发明能够获得具有靶向神经细胞的鼠源FUNDC1融合蛋白。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种以TTC作为神经元细胞靶向基因的融合蛋白的诱导表达。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一个重大的全球公共卫生问题，糖尿病发病率逐年增加，已成为发达国家继心血管和肿瘤之后第三大非传染性疾病。据流行病学研究调查，全球糖尿病总体患者约为4.25亿人次，我国糖尿病患者约占全球1/3。随着生活水平提高以及生活方式改变，糖尿病发病率呈日益增长的趋势。糖尿病神经病变是糖尿病的重要并发症，其形式多样，主要包括周围神经病变、自主神经病变等，这些病变严重影响了糖尿病患者的生活质量，而氧化应激和线粒体功能障碍被认为在糖尿病周围神经病变中起主要作用。

近几年，在难治性疾病的临床治疗中，基因靶向治疗受到人们广泛关注，成为基因治疗领域的研究热点。

Fundc1(包含FUN14结构域蛋白1)是一种线粒体外膜蛋白，对于线粒体自噬和线粒体相关的内质网膜(MAM)很重要。Fundc1是一种哺乳动物线粒体自噬受体，可与LC3相互作用并将LC3招募到线粒体以进行线粒体自噬。作为一种新型MAM蛋白，Fundc1控制着多种生理和病理过程，例如线粒体动力学、钙离子失调。破伤风毒素(Tetanus toxin,TeNT)是破伤风杆菌产生的，它可特异地与神经元末梢结合并内在化，逆行运输至神经元，并可跨神经元间迁移。破伤风毒素片段(the nontoxic carboxylic fragment of tetanus toxin,HC)是一种新的周围神经靶点，可定向表达于外周神经[1]。TeNT蛋白由一个重链和一个轻链组成，重链介导与神经末梢结合，轻链产生神经毒性。重链的C端片段(Tetanus toxin CFragment,TTC)由451个氨基酸组成，能与神经特异结合并逆行运输，而没有神经毒性。因而TTC可作为靶向神经元并逆行运输的非毒性分子，目前已有相关报道。

重组蛋白技术是应用基因克隆技术，将目的基因片段重组上质粒载体，之后将其转入宿主细胞从而表达特定的重组蛋白分子。当前应用的重组蛋白表达体系主要包括大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞以及CHO等表达系统。大肠杆菌(E.coli)重组蛋白表达系统经过多年的发展，相对于其他表达体系，已经非常成熟。其优点具有遗传背景简单；繁殖快、成本低、抗污染能力强；表达量高、分离纯化相对简单、稳定性好；商品化的载体和菌株种类齐全、适用范围广等。

[1]Pego A P,Lopes C,Oliveira H,et al.In vivo targeted gene deliveryto peripheral neurons mediated by neurotropic poly(ethylene imine)-basednanoparticles[J].International Journal ofNanomedicine,2016,11.