[发明专利]施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶及其应用

说明书

本发明涉及施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI‑RE核酸酶及其应用，属于生物技术领域。本发明以PIWI‑RE家族为对象，首次公开施氏假单胞杆菌(Pseudomonasstutzeri DSM 4166)来源的PIWI‑RE(PsPIWI‑RE)的核酸酶催化特性和作用机制。本发明公开的蛋白、核酸、多酶体系、试剂盒和方法能够对细胞内和细胞外的遗传物质进行位点特异性修饰，为开发基于原核生物来源PIWI‑RE介导的基因编辑、修饰及分子检测技术提供了一种新工具，可应用于核酸检测、基因编辑和基因修饰等生物技术领域。该研究首次阐明PIWI‑RE蛋白工作模式，对于拓展对PIWI超家族的认识，挖掘PIWI家族的新型基因编辑酶具有重要的意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种施氏假单胞杆菌来源的PsPIWI-RE核酸酶及其应用。

背景技术

Argonaute(Ago)蛋白具有短链siRNA/DNA引导的单链DNA/RNA剪切特性，在特定位点切割与siRNA/DNA互补配对的DNA/RNA底物，研究表明其在生物体细胞免疫防御及代谢调控中发挥重要作用。真核生物中作为knockdown目标基因的RNAi技术就是依赖Ago蛋白对靶标RNA的剪切功能，并已成功用于药物开发和疾病治疗。近年来，原核生物Ago同源蛋白(pAgo)，尤其是来源于高温细菌和古菌的，表现了在单链、短DNA或RNA指导的DNA剪切功能，显示了在遗传调控方面的潜力。与目前通用的CRISPR相关酶(Cas)相比，其以碱基配对为基础的精准核酸剪切特性是一致的，然而一方面pAgo对靶标序列无特定motif(PAM/protospacer adjacent motif)的要求，显示了更广泛的基因编辑潜力；另一方面pAgo仅对单链DNA(ssDNA)具有剪切作用，而Cas系统酶则对双链DNA(dsDNA)具有催化作用，这限制了pAgo酶对基因组的编辑，因此以Ago为工具实现体内基因编辑还鲜有报道。理解Ago蛋白的作用机制、探索其对双链DNA的作用规律，并开发广谱基因编辑工具的潜力亟需深入研究。因此挖掘Ago家族新成员，开发更加高效、特异的新Ago蛋白显得尤为重要。

研究报道，常温微生物来源的Ago蛋白能在体外使用一对指导链剪切质粒DNA，例如来自嗜中温原核生物Clostridium butyricum和Limnothrix rosea的CbAgo以及LrAgo等蛋白能够在常温(37℃)条件下利用siDNA guide特异性剪切单链DNA(ssDNA)，也能利用一对siDNA guide剪切双链质粒DNA。但是，它们剪切双链DNA的能力很大程度上取决于双链DNA的GC含量，即其活性依赖于双链DNA的局部解旋。当剪切部位的GC含量高于31％时，双链DNA解旋有限，因此无法实现剪切。利用Ago蛋白在常温下剪切任意GC含量的质粒DNA或线性双链DNA底物，尚未见报道。

因此，寻找能与解旋作用相协同的Ago内切酶，将有利于提高对双链DNA的作用，为基因编辑提供新工具酶。

Eric等人报道了Thermus thermophilus来源的UvrD解旋酶同源蛋白在高温条件下促进TtAgo剪切线性双链DNA。对不同来源的中温解旋酶研究较多，然而其协助中温Ago实现双链DNA剪切尚无报道。本申请的发明人前期也探索了E.coli来源的RecA同源重组酶等蛋白质与NgAgo、CbAgo等蛋白的多酶组合对双链DNA的剪切作用，尚未发现明显的剪切效果。自然界是否已进化能协助Ago蛋白进行基因组编辑的解旋酶尚不可知。