[发明专利]一种检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸,以及含有该寡核苷酸的试剂盒及应用

权利要求书

1.一种检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸，包括上、下游引物和荧光标记探针，所述上下游引物分别为

上游引物 5′-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3′；

下游引物 5′-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3′；

所述荧光标记探针为：5′-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG -3′，所述荧光标记探针的5′端标记FAM荧光基团，3′端标记BHQ1荧光基团。

2.一种含有检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为PMA-qRT-PCR试剂盒，所述试剂盒包括以下组分，叠氮溴化丙锭溶液PMA，磷酸盐缓冲盐溶液PBS，RNA提取试剂，扩增反应液，阳性质控品，作为阴性对照的灭菌去离子水。

3.根据权利要求2所述含有检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸的试剂盒，其特征在于：以20%二甲基亚砜配制叠氮溴化丙锭溶液，所述叠氮溴化丙锭溶液的浓度为2mM。

4.根据权利要求2所述含有检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸的试剂盒，其特征在于：所述扩增反应液为1.25×，含有One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix、上下游引物浓度为0.25μM、Taqman探针浓度为0.25μM。

5.根据权利要求2所述含有检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸的试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为灭活的新型冠状病毒或假病毒;所述假病毒质控品通过基因扩增、质粒构建和包装制备而成，合成的基因包括新型冠状病毒RdRp基因，采用数字PCR对灭活的新型冠状病毒或假病毒质控品进行定值，并稀释至500拷贝/ml，分装后-20℃保存。

6.一种含有检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸的试剂盒的应用，包括以下步骤：

第一步、样本PMA预处理；

第二步、用RNA提取试剂提取样本中总RNA；

第三步、配制qRT-PCR反应体系，将第二步提取得到的总RNA作为模板加入到装有扩增反应液的PCR管中；

第四步、将上述配制的qRT-PCR反应体系置于荧光定量PCR仪中进行PCR扩增反应；

第五步、结果判断。

7.根据权利要求6所述含有检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸的试剂盒的应用，其特征在于：所述第一步中，将PMA加入到待测样本中使其终浓度为200μM，同时取等量PBS加入到待测样本中作为未处理对照组，并做好标记，以同样的方法对阳性质控品进行PMA预处理；将所有样本管混合均匀，室温孵育10min；孵育完成后使用BLU-V曝光系统或卤素灯曝光15min，曝光条件为650W，样品置于冰上，距离灯源20cm。

8.根据权利要求6所述含有检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸的试剂盒的应用，其特征在于：所述第三步中，qRT-PCR反应体系的配制，取5μl第二步提取得到的总RNA作为模板加入到装有20μl扩增反应液的PCR管中，同时取5μl阴性对照加入到PCR管中。

9.根据权利要求6所述含有检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸的试剂盒的应用，其特征在于：所述第四步中，PCR扩增反应条件为52℃ 5 min；95℃ 10 sec； 95℃ 5 sec，60℃ 30 sec，共40个循环；在每个循环结束时收集FAM荧光信号。

10.根据权利要求6所述含有检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸的试剂盒的应用，其特征在于：所述第五步中，试剂盒质控标准为阴性对照无扩增曲线；新型冠状病毒阳性质控品PBS处理组出现典型S型扩增曲线，Ct值小于40，且质控品PBS处理组Ct值和PMA预处理组Ct值之间存在统计学差异，阴性结果Ct值记为40；当以上对照不成立时，此次实验视为无效；在符合质控标准下进行结果判断，阴性结果Ct值记为40，当样本PMA预处理组Ct值和未处理对照组Ct值之间无统计学差异，则提示样本中的新型冠状病毒具有感染性的可能性较大；当PMA预处理组Ct值和未处理对照组Ct值之间存在统计学差异，则提示样本中的新型冠状病毒无感染性或者感染性较低。