[发明专利]一种检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸,以及含有该寡核苷酸的试剂盒及应用

说明书

本发明涉及一种检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸,以及含有该寡核苷酸的试剂盒及应用，属于生物技术领域。本发明的试剂盒，包括以下组分：（1）叠氮溴化丙锭（PMA）溶液；（2）磷酸盐缓冲盐溶液（PBS，PH=7.4）；（3）RNA提取试剂；（4）扩增反应液，包括One Step PrimeScript III RT‑qPCR Mix、上下游引物和Taqman探针；（5）阳性质控品；为灭活的新型冠状病毒或假病毒；（6）阴性对照，灭菌去离子水。本发明具有检测灵敏度高、检测时间短、操作步骤简单、应用范围广等特性，且在生物安全二级（BSL‑2）实验室即可开展，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸,以及含有该寡核苷酸的试剂盒及应用，属于生物技术领域。

背景技术

由新型冠状病毒（SARS-CoV-2或2019-nCoV）导致的新冠肺炎（COVID-19）疫情，以极快的速度造成了全球性大流行，不仅严重威胁了人类健康，而且造成了全球巨大的经济损失。各种新型冠状病毒变异株的出现使得全球可能面临多轮新的疫情高峰出现。据世界卫生组织（WHO）专家推测，新冠肺炎疫情在短期内不会消失，可能会出现多次反复，持续多年。

在疫情常态化防控过程中，尚存在一些亟待解决的问题：如新冠感染者的病毒排毒时间不等同于病毒具有传染性的时间，直接采用常规的Real-time PCR进行病毒核酸检测无法确定检测到的病毒是否具有感染性，从而直接影响到治疗方案的选择以及感染者能否出院或者解除隔离；此外，环境样本、冷链食品核酸检测呈阳性，亦无法判断检测到的是活病毒、死病毒还是污染的核酸片段，特别是消毒后的环境和冷链食品仍可能核酸检测阳性，均影响进一步的防控和处置措施。病毒分离培养是确定样本中的新型冠状病毒是否具有感染性最为直接的手段，但培养需要在生物安全三级（BSL-3）实验室进行，耗时费力，而且培养是否成功还取决于样本中的病毒载量。因此，亟待建立一种快速、可靠的，可检测样本中的新型冠状病毒是否具有感染性的方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中检测病毒感染性存在的缺陷，提出一种检测样本中新型冠状病毒感染性的PMA-qRT-PCR试剂盒及应用，适合对新型冠状病毒感染者的临床样本、被新型冠状病毒污染的物品或环境样本、以及消毒后仍核酸检测阳性的物品或环境样本进行快速检测，为判断样本中的新型冠状病毒是否具有感染性提供辅助手段。

本发明首先提供一种检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸，通过对多组靶向新型冠状病毒不同靶基因区域的核酸检测寡核苷酸进行筛选，得到一组检测新型冠状病毒感染性的寡核苷酸，包括上、下游引物和荧光标记探针，所述上下游引物分别为

上游引物 5′-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3′；

下游引物 5′-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3′；

所述荧光标记探针为：5′-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG -3′，所述荧光标记探针的5′端标记FAM荧光基团，3′端标记BHQ1荧光基团。

叠氮溴化丙锭（PMA）是一种具有高亲和力的光敏反应DNA结合染料，光解后，染料上的光敏叠氮基转变为高反应性的氮烯自由基，极容易与结合部位核酸的碳氢化合物形成牢固DNA修饰，修饰后的DNA不能用作PCR反应模板被扩增。由于PMA只能选择性修饰死细胞暴露的DNA，不能透过活的细胞膜，所以将PMA与PCR结合已成功应用于检测和定量活细菌。对于病毒，特别是单链RNA病毒，没有DNA双螺旋结构，将PMA与PCR结合不一定能有效区分其死活状态（J. Virol. Methods 164:51-54）。本发明通过对qPCR引物、探针进行筛选，对样本PMA预处理条件进行优化，并引入阳性质控品对检测过程和结果判定进行质控，进一步提供一种可检测样本中新型冠状病毒感染性的PMA-qRT-PCR方法及试剂盒，进而为判断新型冠状病毒的感染性提供参考。具体如下：一种含有寡核苷酸的检测新型冠状病毒感染性的PMA-qRT-PCR试剂盒，包括以下组分：

（1）叠氮溴化丙锭（PMA）溶液；