[发明专利]头颈鳞癌治疗分子探针及应用

权利要求书

1.头颈鳞癌治疗分子探针及应用，其特征在于：对硒化合物对头颈鳞癌细胞基因组稳定性的影响进行研究：

步骤一.研究硒化合物激活ATR通路的作用；

步骤二.硒化合物对TCAB1转录失活的作用分析；

步骤三.研究ATR通路和TCAB1通路的相互作用；

步骤四.分析硒化合物作用下头颈鳞癌细胞的基因组稳定性干预治疗的可行性；

研究时所述肿瘤细胞基因组包括两种人口腔鳞癌细胞系(HSC-3、Cal-27)、鼻咽癌细胞系CNE1和腺样囊性癌细胞系ACC2，所述硒化合物的作用试剂为亚硒酸钠与硒代-L-蛋氨酸。

2.根据权利要求1所述的头颈鳞癌治疗分子探针，其特征在于：所述步骤一中的具体研究方法如下：

a.系统分析ATR通路信号传导在硒化合物处理头颈鳞癌细胞中的分子表达：利用免疫荧光和免疫印迹检测ATRIP，TopBP1，9-1-1和Mre11-Rad50-Nbs1复合体，H2AX，CTIP和PCNA信号分子灶点形成的能力；

b.单链DNA中间体的形成：利用磷酸化RPA和非变性BrdU免疫荧光手段，检测硒化合物处理头颈鳞癌细胞中单链DNA(ssDNA)的形成能力；

c.DNA复制叉的稳定性：BrdU和IdU交互标记细胞，观察紫外线或喜树碱处理头颈鳞癌细胞细胞后IdU单色荧光标记区域的长度，以指示复制叉重启和延伸的能力；

d.硒化合物作用蛋白的筛选：构建腺病毒载体，表达带有TAP标签的硒化合物相关蛋白,制备高滴度腺病毒载体并感染头颈鳞癌细胞(108细胞数)，提取总蛋白或核蛋白，利用共价结合兔IgG的磁珠(Dynal beads)特异吸附硒化合物TAP及相互作用蛋白质复合体，经SDS-PAGE电泳分离选切特异蛋白条带后MALDI-TOF或液相色谱关联的质谱分析，鉴定多肽指纹，筛选与ATR通路相关的靶蛋白。

3.根据权利要求1所述的头颈鳞癌治疗分子探针，其特征在于：所述步骤二中的具体研究方法如下：

a.硒化合物对端粒酶复合体各成分含量和Cajal体定位的影响：TRAP-ELISA检测端粒酶活性；Southern blot检测端粒长度；Western blot检测TCAB1、hTERT、dyskerin；Nothernblot检测hTR水平；利用TCAB1、p80-coilin(CB的标志蛋白)、dyskerin和hTERT的抗体进行免疫共沉淀实验检测TCAB1在硒化合物作用下与dyskerin、hTERT、CB的相互作用，结合FISH实验检测TCAB1与hTR的相互作用；

b.硒化合物对TCAB1启动子顺式插入调控:在数据库查找TCAB1基因的启动子序列，设计引物进行PCR扩增，对PCR产物进行454测序，比对硒化合物阳性和硒化合物阴性组的TCAB1启动子序列的变化；

c.硒化合物对TCAB1调控的信号传导途径研究：拟采用基因芯片技术比较硒化合物阳性和硒化合物阴性组肿瘤细胞的基因表达谱差异性，用生物信息学GSEA进行聚类分析、pathwa分析，寻找到参与这些效应分子(NF-κB、c-Myc、Sp1、PKC、p53)调节的信号途径，并用实时荧光定量PCR或Western Blot技术验证主要信号分子的变化，确定硒化合物失活TCAB1可能的信号转导途径；

d.TCAB1启动子结合蛋白的垂钓：构建TAP-TCAB1腺病毒载体，感染硒化合物阳性和硒化合物阴性组，提取总蛋白或核蛋白，用磁珠特异吸附TCAB1-TAP及相互作用蛋白质复合体，经MALDI-TOF分析，鉴定多肽指纹，筛选与TCAB1激活通路相关的信号蛋白(c-Myc、Sp1、PKC、p53)。