[发明专利]一种在植物原生质体中转化质粒的方法及其应用

权利要求书

1.一种在植物原生质体中转化质粒的方法，其特征在于：至少包括将

原生质体制备的混悬液、高纯度和浓度的外源DNA质粒和PEG/Ca²⁺溶液进行孵育转化；孵育转化后用W5溶液离心、混悬步骤；外源DNA质粒的高纯度为吸光度值OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.6-2.0，所述高浓度为2-3 μg/μl；

所述的植物为毛白杨时，所述高纯度和浓度的外源DNA质粒制备包括步骤如下：

A.构建pEGAD表达载体

以毛白杨的cDNA为模板，通过RT-PCR的方法扩增毛白杨的PtHTB9基因，pEGAD载体用Sma I酶进行酶切孵育,用In-fusion无缝克隆酶孵育,再将产物通过热激的方法转到大肠杆菌Top10,在卡那霉素的LB培养基上筛选阳性克隆；其中，PtHTB9基因序列如SEQ ID NO.1所示，正向引物F的序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物 R的序列如SEQ ID NO.3所示；

B.构建pTOPO-Blunt转化载体

将构建好的pEGAD载体用上游和下游引物对35S-GFP-PtHTB9片段进行PCR克隆,将回收产物与pTOPO-Blunt载体用T4连接酶连接,通过热激的方法转到大肠杆菌Top10,在氨苄霉素的LB培养基上筛选阳性克隆；其中35S-GFP-PtHTB9片段的序列如SEQ ID NO.4所示，上游引物F的序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物R的序列如SEQ ID NO.6所示；

C.高纯度、高浓度质粒提取

将构建好的pTOPO-Blunt35S-GFP-PtHTB9、大肠杆菌Top10菌株用氨苄霉素过夜培养,用质粒提取试剂盒进行质粒大提和浓缩；

或所述植物为巨尾桉时，所述高纯度和浓度的外源DNA质粒制备包括如下步骤：

A.构建pEGAD表达载体

以巨尾桉DH32-29的cDNA为模板，通过RT-PCR的方法扩增巨尾桉DH32-29的EgHTB9基因，pEGAD载体用Sma I酶进行酶切孵育，用In-fusion无缝克隆酶孵育,再将产物通过热激的方法转到大肠杆菌Top10,在卡那霉素的LB培养基上筛选阳性克隆；其中，EgHTB9基因序列如SEQ ID NO.7所示，正向引物F的序列如SEQ ID NO.8所示，反向引物 R的序列如SEQ IDNO.9所示；

B.构建pTOPO-Blunt转化载体

将构建好的pEGAD载体用上游和下游引物对35S-GFP-EgHTB9片段进行PCR克隆,将回收产物与pTOPO-Blunt载体用T4连接酶连接,通过热激的方法转到大肠杆菌Top10,在氨苄霉素的LB培养基上筛选阳性克隆；其中，35S-GFP-EgHTB9片段的序列如SEQ ID NO.10所示，上游引物F的序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物R的序列如SEQ ID NO.12所示；

C.高纯度、高浓度质粒提取

将构建好的pTOPO-Blunt35S-GFP-EgHTB9、大肠杆菌Top10菌株用氨苄霉素过夜培养,用质粒提取试剂盒进行质粒大提和浓缩；

所述的原生质体制备的混悬液，即将原生质体和溶剂混悬，其中溶剂为MMg溶液；原生质体与MMg溶液的数量体积比为1-5x10⁵；所述MMg溶液是由0.6M甘露醇、15mM 氯化镁,4mM吗啉乙磺酸组成；所述PEG/Ca²⁺溶液中PEG为PEG_4000，所述PEG/Ca²⁺溶液是由PEG₄₀₀₀3g, ddH₂O2.25ml，0.8M 甘露醇1.785ml,1.0 M 氯化钙 0.75ml组成；所述孵育转化所需的时间为40-50 min；温度23℃；所述W5溶液是由154mM NaCl, 125mM CaCl₂, 5mM KCl, 2mM MES, 5mM葡萄糖组成。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述原生质体制备的混悬液

与外源DNA质粒的体积比为10:1-2；所述原生质体制备的混悬液与所述外源DNA质粒的体积之和与所述PEG/Ca²⁺溶液的体积相等。