[发明专利]一种在植物原生质体中转化质粒的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种在植物原生质体中高效转化质粒的方法及其应用，其利用特定比例的PEG/Casupgt;2+/supgt;溶液,将通过酶解液解离的植物的原生质体,与外源DNA质粒进行孵育,外源基因能够显著表达。本发明通过在植物原生质体中导入外源基因,对于通过基因工程领域培育植物新种质具有极大的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种基于植物基因工程领域,尤其涉及一种在植物原生质体中高效转化质粒的方法及其应用。

背景技术

白杨是我国黄河流域的主要人工林种植树种,由于其生长迅速、抗旱、耐贫瘠、树形优美,在我国北方地区广泛种植,是城市街道、高速公路景观绿化的主要树种,也是维护治理生态环境中防风固沙、退耕还林的重要树种,同时白杨在木材加工、造纸等林业产业中也发挥着重要作用。目前我国的杨树人工林总面积为850万公顷,已经超过1亿亩（2018年数据）,位居世界第一。但是传统的杨树种苗育种存在育种周期长、难以对优良性状进行多元化整合的缺点,同时也存在优质品种相对单一,难以满足我们国家对生态建设、植被恢复、增加森林碳汇能力的多元化需求。

桉树是我国南方地区广西、广东、福建等地广泛种植的经济树种,每年贡献了我国超三分之一的木材产量,对维护我国“木材安全”,建设木材战略储备基地起到了关键支撑作用。仅我国的广西省,种植面积达到3000多万亩,木材产量2500多万立方米,经济效益规模已经达到4700多亿。同时桉树在减排吸碳环保方面,每年吸收二氧化碳超过8.5亿吨,也为国家的环保事业做出巨大贡献。然而桉树在发展过程中也被冠以了“抽水机”、“抽肥机”的外号,原因是桉树生长迅速,对于水肥的需求很大。如何通过基因工程手段培育高效利用“水分”“肥料”的桉树新品种,对于打赢“种业翻身仗”,解决林业种苗产业中的难点具有重要意义。

为了解决上述白杨和桦树的短缺及多元化需求，亟需提供新的育种方法解决林业育种育苗难题。

发明内容

植物细胞去除细胞壁以后的各种结构一起被定义为原生质体,没有了细胞壁的阻挡,外源分子能够更容易的通过各种转化方法进入到细胞中去。但是如何能够高效的将外源DNA质粒转入原生质体中成为重要的限制因素,目前常用的电击法存在周期长、效率低（5%以下）的显著缺点。针对上述缺陷，本发明提供一种在植物原生质体中高效转化质粒的方法,利用高纯度和浓度的外源DNA质粒,将原生质体与PEG/Ca²⁺溶液和MMg溶液孵育，进行高效外源DNA质粒的转化。该方法能使转化效率提升至70%,具有巨大的应用潜力。

本发明还提供了一种在原生质体中高效转化质粒的方法在白杨和桦树育种中的应用。

本发明还提供了一种白杨或桉树的原生质体。

本发明还提供了白杨或桉树的原生质体用于外源基因表达中的用途。

本发明是通过下述技术方案实现的：

一种在植物原生质体中高效转化质粒的方法，至少包括将原生质体制备的混悬液、高纯度和浓度的外源DNA质粒和PEG/Ca²⁺溶液进行孵育转化。

一种实施方式，一种在植物原生质体中高效转化质粒的方法，还包括孵育转化后用W5溶液离心、混悬步骤。

本发明所述的原生质体制备的混悬液即将原生质体和溶剂混悬，其中溶剂为MMg溶液。

本发明所述的原生质体与MMg溶液中数量体积比1-5x10⁵个/ml。该范围内有最大的转化效率，数量体积太低，原生质体转化得率太低，数量体积太高的话操作过程中，原生质体互相积压，容易造成破碎。

本发明所述的混悬液与外源DNA质粒的体积比为10:1-2。

本发明所述混悬液与所述质粒液的体积之和与所述PEG/Ca²⁺溶液的体积相等。