[发明专利]一种检测高盐高蛋白质生物样品中多聚核苷酸激酶的方法

权利要求书

1.一种用于高盐、高蛋白质复杂生物基质样品中 T₄ 多聚合核苷酸激酶（T₄ PNK）活性检测的寡核苷酸序列，其特征在于它包括五条DNA链；DNA链分别是 T₂-DNA链、L-DNA链、T₁-DNA链、ssDNA 链和Target-DNA链；其中，T₂-DNA链、T₁-DNA链均与 L-DNA链互补；ssDNA为暗态银簇模板链；Target-DNA由两部分组成，3’端含有富G序列，5’端与银簇模板链 ssDNA 部分互补，同时也与L-DNA 链互补，并且与ssDNA互补的碱基个数小于与L-DNA互补碱基个数；

传感中使用的 T₂-DNA、L-DNA、T₁-DNA、ssDNA 和 Target-DNA序列如下所示：

T₂-DNA：TAGGCAGGAG；SEQ ID NO.1

L-DNA：CCCCACCCCACCCCACCCGCCACATGTTATTCCAAAATTAGACTCCTCCTGCCTACGCCACCACCT；SEQ ID NO.2

T₁-DNA：GAGGTGGTGG；SEQ ID NO.3

ssDNA：CCCTTAATCCCCGCCACATGTTATTCCAAA；SEQ ID NO.4

Target-DNA:

TTTGGAATAACATGTGGCGGGTGGGGTGGGGTGGGG；SEQ ID NO.5。

2.采用权利1要求所述寡核苷酸序列用于高盐、高蛋白质的复杂生物基质样品中 T₄ 多聚合核苷酸激酶（T₄ PNK）活性检测的寡核苷酸序列的方法，其特征在于按下述步骤进行：

（1）以单链T₂-DNA为起点；首先，T₄ PNK存在时，催化磷酸基团(Pi) 从三磷酸腺苷(ATP)的 γ 位置转移和交换到单链 T₂-DNA 的 5'-OH末端，实现5'-OH末端到5'-PO₄末端的转换，便于后续T₂-DNA与T₁-DNA的连接；然后，T₂-DNA与T₁-DNA经 T₄ DNA连接酶作用形成一条长链结构T-DNA；

L-DNA与T-DNA形成互补的双链DNA，经 Vent^® (exo-) DNA聚合酶作用，dNTPs排列在L-DNA互补序列上，形成有缺口的双链DNA，缺口内切酶Nt.BstNBI作用于dsDNA的缺口，切割下富G序列Target-DNA，循环DNA聚合和切刻过程，富集Target-DNA；

该部分由T₂-DNA经酶作用一步步合成Target-DNA；

（2）加入定量的AgNO₃溶液，涡旋使Ag⁺与Cl^-充分结合，加入NaIO₄溶液或者加入Zn(NO₃)₂溶液氧化蛋白质，过量的Ag⁺用(NH₄)₂S₂O₈除去，然后涡旋使AgCl沉淀分散防止包裹Target-DNA，离心取出上清液；

向上清液中，加入十二烷基磺酸钠(SDS)溶液；按照ssDNA、AgNO₃、NaBH₄摩尔比1:1:1~1:10:10，加入AgNO₃水溶液和NaBH₄溶液，形成暗态ssDNA/AgNCs，暗态ssDNA/AgNCs与Target-DNA混合后测荧光；

测荧光时，激发波长为 565 nm，发射波长为620 nm；

（3）当复杂生物基质样品内不存在T₄ PNK时，T₂-DNA 无法完成5’磷酸化过程，不能进一步反应，从而得不到Target-DNA；溶液中的ssDNA/AgNCs仍然处于暗态，无法转换成能产生强荧光发射的亮态ssDNA/AgNCs；所述的复杂生物基质样品指的是Hela细胞、人血清和尿液中T₄ PNK。

3.权利要求2所述采用寡核苷酸序列的酶促反应，与AgNO₃、NaIO₄、Zn(NO₃)₂、SDS溶液后处理，可用ssDNA/AgNCs输出荧光信号，用于高盐、高蛋白质的复杂生物基质样品中 T₄ 多聚合核苷酸激酶（T₄ PNK）活性检测的寡核苷酸序列方法在用于提高复杂生物基质样品抗干扰能力提高稳定方面的应用。