[发明专利]一种检测高盐高蛋白质生物样品中多聚核苷酸激酶的方法

说明书

本发明公开了一种寡核苷酸序列稳定的银纳米团簇（ssDNA/AgNCs）用于高盐、高蛋白质等复杂生物基质样品中T₄多聚合核苷酸激酶（T₄ PNK）活性检测的新方法。复杂生物基质样品中存在大量盐分和蛋白质，需要经过高倍数稀释，否则难以实现荧光检测T₄ PNK。研究发现，当T₄ PNK等酶促反应完成时，首先加入定量AgNO₃溶液，其次加NaIO₄和Zn(NO₃)₂溶液氧化蛋白质，最后向溶液中加入暗态ssDNA/AgNCs，孵育后可得到亮态ssDNA/AgNCs，进行荧光检测T₄ PNK的活性。该方法检测灵敏度高，抗干扰能力强，无需稀释即可适用高盐、高蛋白质的复杂生物基质样品。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域的基因工程工具酶和荧光纳米材料ssDNA/AgNCs，公开了一种ssDNA/AgNCs用于高盐高蛋白复杂生物基质样品中T₄多聚合核苷酸激酶（T₄ PNK）活性检测的新方法，拓展了ssDNA/AgNCs在复杂样品中检测的应用。

背景技术

基因工程的工具酶是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取重组体 DNA 制备等程序中所需要的酶类。基因工程常用的工具酶，主要是核酸酶、聚合酶、连接酶、DNAzyme和其他修饰酶等。本实验着重介绍四种基因工程工具酶，分别是T₄ PNK酶、T₄ DNA 连接酶、Vent^® (exo-) DNA酶和 Nt.BstNBI酶。T₄ PNK来自携带克隆的 T₄ PNK 基因的大肠杆菌菌株，催化 Pi 从 ATP 的 γ 位置转移和交换到多核苷酸和核苷 3'-单磷酸的 5'-羟基末端(5’-OH)，进而 T₄ DNA 连接酶将催化5'-磷酸末端(5’-PO₄)和3’-羟基末端(3’-OH)形成磷酸二酯键从而连接两个DNA片段。Nt.BstNBI是一个缺口内切酶，它识别 DNA 双链体的不对称序列 5’-GAGTC-3’，并且在距离 3’末端四个碱基处仅切割一条链，可以与 Vent^® (exo-) DNA聚合酶于55℃协同反应，因此 Nt.BstNBI 有助于循环放大检测信号，实现对目标物的低浓度检测。

银纳米簇（AgNCs）是由几个到几十个银原子组成，它们的超小尺寸接近电子的费米波长，从而其连续的能带被分离成多个独立的能级，展示出分子特性如强荧光性，解决了传统荧光染料光漂白的问题，可作为一种稳定的可控荧光信号源用于生物分子检测。其中，以ssDNA为模板合成的银纳米簇制备简单，往往具有较高的荧光量子产率、光稳定性、发射波长依赖于DNA序列和良好的生物相容性等优点。ssDNA/AgNCs的荧光变化有两种类型。一种是靠近富鸟嘌呤(G)的DNA序列，导致AgNCs的荧光显著增强，而另一种是ssDNA/AgNCs与其互补寡核苷酸杂交，导致AgNCs荧光发生变化。基于不同的荧光“开启”和“关闭”模型，ssDNA/Ag NCs 已成功应用于检测各种生物学上重要的分析物。尽管有这些有利因素，目前基于 ssDNA/Ag NCs 的荧光传感器仍然存在高背景、抗干扰能力弱和相对较低的灵敏度。为提高抗干扰能力，测定样品前进行高倍数稀释尤为重要，但这使得操作变得复杂，灵敏度同样受到挑战。此外，为解决ssDNA/Ag NCs灵敏度低的问题，采用相应扩增方式富集DNA尤为重要。迄今为止，扩增时常用的基因工程工具酶仅限于Exonuclease III (E. coli)，限制了ssDNA/Ag NCs在分子生物学领域的应用。