[发明专利]猪潜能扩展干细胞培养基及其培育方法

说明书

本发明公开了一种建立猪潜能扩展干细胞（pEPSC）的培养基及其培育方法，所述培养基的配方为：DMEM/F‑12培养基、20%KSR、1×(vol/vol)MEM NEAA、1×(vol/vol)谷氨酰胺‑青霉素‑链霉素、0.1 mM的β‑巯基乙醇、10supgt;3/supgt; U人LIF蛋白、1.0μM的PD0325901、3.0μM的CHIR99021、4.0μM的JNK抑制剂VIII、10.0μM的SB203580和5.0μM的XAV939。通过将猪8‑细胞胚胎加入本发明所述培养基中进行培养，经培养、传代和扩增得到猪潜能扩展干细胞。本发明成功建立了高表达OCT4、SOX2、NANOG的猪潜能扩展干细胞。

技术领域

本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及潜能扩展干细胞培养基及其培育方法。

背景技术

虽然小鼠胚胎干细胞培育技术手段已非常成熟，但是在将近20多年的研究中，研究者们始终没有获得类似小鼠的具有真正全能性的猪胚胎干细胞系（pES）[1, 2]。大多数研究人员发现在通过各种培养手段和体内分离培养出的猪pES细胞系很难维持胚胎干细胞（ES）样状态，pES细胞高表达Nanog、Rex1和TDGF1等直接参与向外胚层干细胞分化的细胞因子，也就是说pES细胞表现出强烈的分化成外胚层ES样状态的趋势[3-5]。甚至Sox2、bFGF、FG·FR1、FGFR2等仅在猪外胚层细胞中表达的细胞因子也在分离培养的pES细胞系中表达[6-8]。究其原因，主要是因为并不能确定可以维持猪胚胎干细胞多能性状态的培养液和细胞信号通路。研究者们针对于这两个主要因素，仿照其他哺乳动物胚胎干细胞建系的成功研究做了一系列的尝试，目前却只能获得具有一定多能性的“猪外胚层样胚胎干细胞系（EpiSC-like pESCs）”[5, 9, 10]。

除了用传统的方法从内细胞团分离培养ES细胞，近年来，诱导多能干细胞（iPS）技术也被应用到建立pES细胞系中来，但是截至目前，利用iPS技术建立起来的piPS细胞系都显示出启动多能性状态，具有扁平的形态和FGF以及许多与mEpiSCs类似的特征，并且piPS细胞系在形态学、AP活性、信号通路的激活和多能标记物的表达等方面与EpiSC-likepESCs细胞系非常相似，也就是说piPSC类似于“EpiSC-like pESCs”[8, 9, 11]。并且迄今为止，也没有获得嵌合体的成功案例。

猪潜能扩展干细胞（EPSCs）比目前的干细胞系具有更大的分化、扩增潜力，它们具有发育胚胎中第一细胞的特征，并且可以发育成任何类型的细胞[12]。其获取阶段在受精卵还只分裂为4或8个细胞时期，这些细胞比从内细胞团发育阶段分离获取的ES细胞更少进入分化进程，实验数据显示其全能性更高，能生成ESCs、EpiSCs等所有的干细胞类型，甚至是滋养层干细胞。其通过靶向调节着床前小鼠胚胎谱系分化的关键分子通路，具有广泛胚外和胚胎谱系分化倾向的扩增潜能干细胞可以成功地衍生出[9, 12]。大量的研究已经确定了丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路、Src通路、Hippo通路和核糖基化多聚ADP（PARP）细胞因子在胚胎干细胞分化中的主要作用[10, 13]。特别是Src阻断剂部分阻断了桑葚胚的发育，影响了胚泡中的滋养外胚层和原始内胚层的分化[14]。基因Parp1/2和tankyrase 1/2(Tnks/ Tnks2) 的表达降低分别导致胚胎干细胞的分化和滋养层的分化，而敲除Parg基因会直接影响PARP水解能力，从而导致滋养层干细胞分化能力和滋养外胚层的缺失[15]。另外，Wnt信号在脊椎动物和滋养细胞的早期发育中也起着重要作用。重要的是，通过Hippo通路的关键效应因子Yap1，Wnt和MAPK通路之间存在信号交叉，从而影响胚胎的分化[12,16]。

尽管现有技术对猪潜能扩展干细胞进行了大量的理论和实验研究，但尚未建立稳定的猪潜能扩展干细胞培育体系。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明提供了潜能扩展干细胞培养基及其培育方法，具体通过如下技术方案实现：