[发明专利]贝类水产品甲型肝炎病毒纳米PCR快速检测试剂盒及其应用

说明书

贝类水产品甲型肝炎病毒纳米PCR快速检测试剂盒及其应用，涉及贝类水产品甲型肝炎病毒检测领域，包括阳性重组质粒pMD‑18T‑VP3、2×HiFiTaq酶、胶体金颗粒溶液、上游引物(CTGATCCGTCCCAGGGTG)和下游引物(CAGGGAACACGAAATCTCAAA)。本发明中制备胶体金颗粒大小均一，分散性良好，透光性好，能提高试剂盒的检测灵敏度。该试剂盒在检测时，操作简便，不需要昂贵的仪器设备，只需要常规的PCR仪和核酸电泳等设备，大大节约了检测成本。本发明的试剂盒敏感性高，与普通PCR检测方法相比敏感性提高了10⁴。本发明的试剂盒特异性强，对贝类水产品常见的病原微生物无法检出。

技术领域

本发明涉及贝类水产品甲型肝炎病毒检测技术领域，具体涉及一种贝类水产品甲型肝炎病毒纳米PCR快速检测试剂盒及其应用。

背景技术

国家标准(GB/T 22287-2008)中贝类水产品中甲型肝炎病毒的检测方法是反转录PCR(RT-PCR)方法和反转录实时荧光PCR(RT-qPCR)方法。RT-PCR方法是一种用途比较广泛的检测方法，但是该方法敏感性不高、特异性较低，尤其是针对低含量甲型肝炎病毒的检测受到极大限制。RT-qPCR方法具有特异性强、灵敏度高等优点，然而该方法需要昂贵的仪器，对引物设计和操作人员的技术要求较高。

微滴式数字PCR(RT-ddPCR)方法具有定量、定性、灵敏度高等优点，已经被应用到检测水产品、蔬菜等食品中的甲型肝炎病毒中，然而该方法中所用到的仪器非常昂贵且对操作人员的要求比较高，一般不适用于大批量样品检测(Persson S,AlmLM E,Karlsson M,et al.A new assay for quantitative detection of hepatitisAvirus[J].Journalofvirological methods,2021,288:114010.)。

甲型肝炎病毒(HAV)可以通过病毒分离得到，常用的细胞系有非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、恒河猴胚肾细(FRhK-4细胞)、人胚肺二倍体细胞(KMB17细胞)等，但甲型肝炎病毒在细胞内生长大多数很难适应细胞，培养周期较长，并且不能产生细胞病变，所以一般情况下不采用细胞培养的方法检测甲型肝炎病毒(谢忠平,宋霞,全文琦,等.细胞内快速连续传代培养甲肝病毒的研究[J].现代预防医学,2006,33(7):1089-90.)。

研究人员利用酶联免疫磁性电化学测定(ELIME)方法测定甲型肝炎病毒，基于多巴胺修饰磁性纳米珠作为固定支持物可提高检测的敏感性，然而制备磁性纳米珠以及用多巴胺修饰磁性纳米珠操作相对较为繁琐(Micheli L,FasoliA,Attar A,et al.An ELIMEassay for hepatitis A virus detection[J].Talanta,2021,234(6):122672.)。

近年来，应用基于近红外免疫层析技术快速检测食源性甲型肝炎病毒的方法，具有良好的特异性和敏感性，与传统的胶体金免疫层析试纸条相比，其检测时间短、检测限更低，然而针对贝类水产品中含极低浓度的甲型肝炎病毒是无法检测(万晓楠,畅晓晖,齐玮,等.基于近红外免疫层析技术快速检测食源性甲型肝炎病毒[J].食品与发酵工业,2020,46(7):213-7.)。