[发明专利]用于合成咖啡酸的构建体，载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产咖啡酸的方法

说明书

本发明提供了一种用于合成咖啡酸的构建体，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的苯丙氨酸酶基因、肉桂酸‑4‑羟化酶基因和对香豆酸‑3‑羟化酶基因三个基因，其中苯丙氨酸酶基因序列如SEQ ID NO.5所示，肉桂酸‑4‑羟化酶基因序列如SEQ ID NO.6所示，对香豆酸‑3‑羟化酶基因序列如SEQ ID NO.7所示。载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产咖啡酸的方法。本发明还涉及包含有所述构建体的载体和包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中生产咖啡酸的方法。一种用于合成咖啡酸的构建体，应用了该构建体的底盘生物能够催化CO₂直接合成咖啡酸，无需外界碳源对香豆酸的支持，成本低，适于进行大规模生产。

技术领域

本发明涉及咖啡酸的合成技术领域，具体而言，涉及一种用于合成咖啡酸的构建体，载体和蓝细菌以及在蓝细菌中生产咖啡酸的方法。

背景技术

蓝藻(Cyanobacteria)作为一种原核生物，其可以同高等植物一样进行光合作用，许多科学家将蓝藻看作一种“光合反应器”，蓝藻仅仅通过固定CO₂即可生物合成大量的人类所需的化工产品和天然植物产物。对蓝藻进行基因改造以进行生物合成具有许多优势：(1)常见蓝藻如鱼腥藻、集胞藻等的基因组都已经完成了测序，由于蓝藻的结构简单，科学家们已经制定出了一套有关蓝藻的基因编辑体系；(2)蓝藻生长繁殖快，适合进行大规模生产；(3)蓝藻的适应能力很强，可以在许多恶劣的环境中生存，只需要给予光照和水即可存活；(4)蓝藻通过固定空气中的CO₂进行生物合成对温室效应的减轻具有一定的缓解作用。因此，使用蓝藻作为合成生物学的底盘生物，具有美好的前景和广泛的应用价值。

咖啡酸(caffeic acid)，又称为“3,4-二羟基肉桂酸”，分子式C₉H₈O₄，分子量180.15。咖啡酸一般存在于植物体内，在常用饮品中亦有存在。咖啡酸作为一种重要的多酚类物质，是非常重要的微量营养素且具有非常高的生物活性，还具有抗氧化、预防心脑血管疾病等药理功能。

咖啡酸目前的主要合成方法是化学合成，具体操作例如：用甲醇将咖啡酸粗提后，经过减压浓缩的方式，将咖啡酸粗品进行第一步提纯；再用热水溶解第一步粗提的产物，以将杂质溶解去除，待冷却后用苯萃取；最后用1％碳酸氢钠溶液洗涤一次，加盐酸中和，经减压浓缩最终产物即为咖啡酸。化学合成咖啡酸不仅需要用到酸、碱、苯等化合物，成本高，而且步骤繁琐不易提纯，在其化学生产过程还会产生大量副产物。这不仅会污染环境，而且副产物的大量产生对经济效益也有严重的影响。

咖啡酸在蓝藻中的生物合成目前也有研究：Xue等在Synechocystis sp.PCC6803的代谢途径引入REF8代谢途径，再加入外界碳源对香豆酸的条件下，将对香豆酸转化为7.2mg/L的咖啡酸。但是需要外界碳源对香豆酸的支持，成本较高，因而无法进行大规模生产。

发明内容

针对现有技术，本发明要解决的技术问题是一种用于合成咖啡酸的构建体，应用了该构建体的底盘生物能够催化CO₂直接合成咖啡酸，无需外界碳源对香豆酸的支持，成本低，适于进行大规模生产。

为解决上述问题，本发明提供一种用于合成咖啡酸的构建体，包含有：在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该启动子控制之下的苯丙氨酸酶基因(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶基因(C4H)和对香豆酸-3-羟化酶基因(REF8)三个基因，其中苯丙氨酸酶基因序列如SEQID NO.5所示，肉桂酸-4-羟化酶基因序列如SEQ ID NO.6所示，对香豆酸-3-羟化酶基因序列如SEQ ID NO.7所示。

可选地，其包含有处于所述在蓝细菌中具有活性的启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。

可选地，所述标记基因为壮观霉素抗性基因片段，所述壮观霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO.3所示。