[发明专利]一种用于重组蛋白的高糖基化修饰序列及其重组猪促卵泡激素和应用

说明书

本发明属于蛋白重组的技术领域，具体涉及一种用于重组蛋白的高糖基化修饰序列及其重组猪促卵泡激素和应用。所述高糖基化修饰序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，经毕赤酵母密码子优化后的核酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。所述重组猪促卵泡激素为猪促卵泡激素的重组蛋白，其为猪促卵泡激素基因与高糖基化修饰序列进行重组融合得到；将本发明经优化的高糖基化修饰序列与猪FSH融合得到重组蛋白，对该蛋白进行毕赤酵母密码子优化修饰后进行高效表达，适度的糖基化修饰以及二硫键的形成提高了重组FSH蛋白的生物学活性和蛋白稳定性，能够高效刺激动物卵巢的增重，具有优异的生物学活性。

技术领域

本发明属于蛋白重组的技术领域，具体涉及一种用于重组蛋白的高糖基化修饰序列及其重组猪促卵泡激素和应用。

背景技术

垂体促卵泡雌激素，又称为促卵泡素(FSH)，是一种由垂体前叶分泌的可刺激卵泡发育和成熟，促进精子生成的激素，属于糖蛋白激素家族。猪促卵泡素(pFSH)蛋白大小为35.5kDa，两个亚基α和β的一级结构分别包含121和131个氨基酸，其中N端的前24和20个氨基酸序列为信号肽。在同一物种中，糖蛋白激素家族都是由共同的α亚基和激素特异性的β亚基组成的异源二聚体，而β亚基则具有激素特异性，决定激素的特定的生理功能，其生物学活性主要由β亚基决定。FSHβ基因在哺乳动物中具有较高的保守性，FSHβ同源性在80％以上，猪源FSHβ与人源FSHβ同源性92％。FSH的β亚基具有两个N-型糖基化位点，其糖基化修饰会影响二硫键的形成，进而影响结构的稳定性，同时糖基化修饰的程度影响FSH的生物学活性。现有研究显示去掉多糖链会降低其刺激细胞产生cAMP的能力，适度的糖基化修饰能够提高FSH的稳定性及生物学活性。

在生殖生理上FSH作用于雌性动物可刺激卵巢生长，增加卵巢重量，刺激卵泡生长发育，FSH对卵巢的作用是通过卵泡的颗粒细胞进行调节的，颗粒细胞表面存在FSH受体。FSH主要应用于辅助生殖领域和畜牧行业，功能主要是在胚胎移植过程中诱导超数排卵，治疗卵巢囊肿及性欲缺乏等。在动物生产上FSH常用于诱导雌性动物的发情和超数排卵，治疗卵巢机能疾病，提高家畜的繁殖力；自然条件下，FSH主要存在于动物垂体和绝经期女性尿液。目前畜牧生产用的FSH主要是从各种家畜的脑垂体组织提取纯化出来的，较常用的是猪垂体FSH。由于FSH与LH的结构相似，且存在结构不均一性，垂体中成分复杂，动物脑垂体组织容易携带病毒，纯化较为困难，限制了FSH的广泛应用。天然激素制剂在具有由于受提取原料的限制生产效率低、杂质不易纯化、易污染外源病毒、提取的半衰期短且活性不稳定等原因。重组FSH能够避免天然激素制剂在应用过程中的不足，体外重组表达FSH为新型激素制剂的生产提供了新的途径。通过基因工程手段及相关分子生物学技术来表达和生产重组FSH蛋白是一种经济、高效的方法。

现有的长效性修饰主要为糖基化修饰策略及长效元件的融合表达，不同的糖基化修饰策略及长效元件的选择，表达量、生物活性、半衰期均有不同程度的差别，合适的糖基化修饰策略及长效元件尤为重要。前期的研究主要集中FSH中的原核表达和酵母表达、CHO细胞表达，FSH及相关融合蛋白的原核表达生产工艺存在包涵体变复性、难以形成二硫键、需脱内毒素等复杂流程。现有研究中在CHO细胞表达中表达量低，生产成本高，难以应用于临床。在毕赤酵母中的表达具有低成本、二硫键形成及糖基化修饰等优势，但表达的FSH蛋白及其类似物活性均不高，表达量低于10mg/L。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于重组蛋白的高糖基化修饰序列及其重组猪促卵泡激素和应用，利用高糖基化序列与FSH的串联表达，通过适度的糖基化修饰及融合蛋白策略显著提高FSH的生物活性及延长半衰期。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种用于重组蛋白的高糖基化修饰序列，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，经毕赤酵母密码子优化后的核酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述高糖基化修饰序列用于蛋白重组融合，高糖基化修饰序列的数量为1个或以上；