[发明专利]一种原代干细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种原代干细胞的培养方法，包括步骤：脐带中组织块剥离以及消化处理，组织块接种后静置培养；第2天和第4天，分别往培养瓶中添加干细胞培养基；第7天，对培养瓶进行全量换液，离心处理，保留沉底再添加干细胞培养基继续培养；第10天和第13天，对培养瓶进行半量换液，再添加干细胞培养基；第15天，停止培养，加入消化液使细胞脱离培养瓶壁，收集细胞，并进行洗涤后获得原代干细胞。本方法培养的原代干细胞，组织块接种时无漂浮问题；Ⅱ型胶原酶使细胞不易老化且残留的Ⅱ型胶原酶后续也会缓慢消化，有利于脐带组织块的充分消化。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术，尤其涉及一种原代干细胞的培养方法。

背景技术

干细胞，是一种多功能细胞，具有多向分化潜能、自我更新能力的细胞，是处于细胞系起源顶端的最原始细胞，在体内能够分化产生某种特定组织类型的细胞。在成体的器官中，干细胞可以通过不断分裂来修复组织。

组织器官的损伤和功能衰竭一直以来是人类健康所面临的一大难题，完美地修复或替代因疾病、战伤、意外事故或遗传因素所造成的组织、器官或肢体的伤残一直是人类的梦想，也是难以攻克的医学高峰。目前的治疗方案均难以完全修复受损的组织、器官或使其功能得以长期恢复。

干细胞是对疾病进行基因治疗的理想载体。造血干细胞具有自我更新、多向分化重建长期造血、采集和体外处理容易等特点。因此是基因治疗最理想的载体细胞之一，以此为基础的基因治疗，在重症免疫缺陷、遗传性疾病、恶性肿瘤、造血干细胞保护、AIDS等领域具有广阔的应用前景。

现有干细胞，一般是通过脐带的原代干细胞进行培养，主要是两种培养方法，具体如下：

第一种方法是组织块植块法。是将脐带组织块剪碎，以定点植块的方法，固定放置培养瓶中，再添加干细胞培养基，经过多次换液，最终获取原代细胞。但该方法容易由于换液时导致组织块移位、漂浮，导致细胞不能从组织块爬出，最终容易导致原代细胞少、甚至培养失败。

第二种常见方法是组织块消化法。用胶原酶将组织块进行消化，消化完全后，经过过滤直接获得细胞，再接种于培养瓶中。此方法容易由于分离的组织块大小不一，导致消化时，不同大小的组织块消化时长不一，容易使得大块组织块消化完全后，小块组织块消化过度，所获得的细胞就会出现损伤。如为避免消化过度，大块组织又容易消化不完全被过滤掉，最终过滤获取的细胞也偏少。

发明内容

基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种培养工艺简单、细胞收获率高的组织块消化法进行原代干细胞的培养方法。

本发明的技术方案如下：

一种原代干细胞的培养方法，包括如下步骤：

第0天，从脐带中剥胶分离出相应组织块，将剥离的组织块经过Ⅱ型胶原酶消化处理10～60分钟；终止消化后，洗涤消化后的组织块；将洗涤后的组织块直接接种到培养瓶中，添加干细胞培养基后将培养瓶静置于培养箱中进行干细胞培养；

第2天和第4天，分别往培养瓶中添加干细胞培养基；

第7天，对培养瓶进行全量换液，并将换下的营养液转移至离心管中离心处理，离心停止后，去除上清，将保留的沉底转入培养瓶中并再添加干细胞培养基，继续培养；

第10天和第13天，对培养瓶进行半量换液，再添加干细胞培养基；

第15天，停止培养，往培养瓶中加入消化液进行细胞的消化，使细胞脱离培养瓶壁，收集细胞，并进行洗涤后获得原代干细胞。

一实施例，所述原代干细胞的培养方法中，第0天中，所述Ⅱ型胶原酶的浓度为0.01％-0.5％。