[发明专利]一种高产天然水蛭素的大肠杆菌工程菌株及其应用

说明书

本发明公开了一种高产天然水蛭素的大肠杆菌工程菌株及其应用，属于生物医药技术领域。本申请以模式生物大肠杆菌为基础，通过游离质粒共表达编码水蛭素的基因hv和编码水蛭酪氨酸磺酸转移酶的基因TPS，构建天然水蛭素的合成途径，获得天然水蛭素的积累菌株。hv的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示，TPS的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明为天然水蛭素的合成提供了新的策略，其生产效率比酶法合成天然水蛭素及从动物组织中提取天然水蛭素明显提高，生产成本大大降低，为天然水蛭素的工业化大规模生产奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种高产天然水蛭素的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

据世界卫生组织统计，每年约有1800万人死于心血管疾病，占全球死亡人数的31%。为了遏制和降低心血管疾病的致死率，需要积极寻找和开发治疗心血管疾病的药物。天然水蛭素（Sulfo-hirudin）是迄今为止发现的最强凝血酶抑制剂，临床上广泛用于心血管疾病的治疗。然而，作为水蛭体内的小分子活性肽，天然水蛭素的分离和纯化异常困难，且天然水蛭素的合成机制尚未解析清楚。因此，构建天然水蛭素的细胞合成工厂困难重重。在此情形下，临床上只能采用微生物细胞表达的重组水蛭素作为替代品，但重组水蛭素的药效仅为天然水蛭素的十分之一。造成这种差异的主要原因是重组水蛭素的酪氨酸残基未经磺酸化修饰，而天然水蛭素的第63位或第64位的酪氨酸⁶³Tyr或⁶⁴Tyr被磺酸化修饰为酪氨酸磺酸酯。

随着蛋白质工程技术、酶工程技术的发展，人们发现酪氨酸磺酸转移酶（Tyrosylprotein sulfotransferase，TPS）在蛋白质翻译后修饰过程中，能在酪氨酸上引入磺酸基团，催化酪氨酸的磺酸化修饰。通过对人源酪氨酸磺酸转移酶的酶学性质进行研究，发现人源酪氨酸磺酸转移酶能催化重组水蛭素磺酸化修饰为天然水蛭素。利用体外酶法合成天然水蛭素成为人们新的选择，但是，体外酶法催化天然水蛭素合成过程中所用的磺酸基供体为3'-磷酸腺苷-5'-磷酰硫酸（3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate，PAPS），价格相当昂贵，从而严重阻碍了天然水蛭素的大规模生产及其临床应用。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供一种高产天然水蛭素的大肠杆菌工程菌株；本发明所要解决的第二技术问题在于提供上述高产天然水蛭素的大肠杆菌工程菌株的构建方法；本发明所要解决的第三技术问题在于提供所述的大肠杆菌工程菌株在一步发酵生产天然水蛭素中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种高产天然水蛭素的大肠杆菌工程菌株，以模式生物大肠杆菌为基础，通过游离质粒共表达编码水蛭素的基因hv和编码水蛭酪氨酸磺酸转移酶的基因TPS。

本申请中，编码水蛭素的基因hv，分别采用了hv1、hv2或 hv3，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7或SEQ ID NO. 8所示；其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5所示。

进一步的，TPS的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；水蛭酪氨酸磺酸转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

所述高产天然水蛭素的大肠杆菌工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

1）构建携带有水蛭素基因和水蛭酪氨酸磺酸转移酶基因的表达载体；