[发明专利]应用于核酸检测的Crispr/LbCas12a突变体蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.应用于核酸检测的Crispr/LbCas12a突变体蛋白的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将编码野生型LbCas12蛋白的全长基因插入pET-N-His-TEV载体的BamHI和XhoI位点之间，构建pET-LbCas12a-wt载体；

（2）根据编码突变后的LbCas12a蛋白的核苷酸序列，针对D156R、G532R、K538V、Y542R和K595R五个突变位点设计引物，进行PCR定点突变；

（3）回收步骤（2）的PCR定点突变产物，插入到步骤（1）构建的pET-LbCas12a-wt载体中，得到LbCas12a-5M原核表达质粒；

（4）步骤（3）的LbCas12a-5M原核表达质粒经转化、表达、纯化得到Crispr/LbCas12a突变体蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中编码突变后的野生型LbCas12蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中扩增D156R、G532R、K538V、Y542R和K595R五个突变位点的PCR引物对分别为：D156R-F/D156R-R、G532R-F/G532R-R、K538V@Y542R-F/ K538V@Y542R-R以及K595R-F/K595R-R；其中D156R-F序列如SEQID No.2所示、D156R-R序列如SEQ ID No.3所示、G532R-F序列如SEQ ID No.4所示、G532R-R序列如SEQ ID No.5所示、K538V@Y542R-F序列如SEQ ID No.6所示、K538V@Y542R-R序列如SEQ ID No.7所示、K595R-F序列如SEQ ID No.8所示、K595R-R序列如SEQ ID No.9所示。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中Crispr/LbCas12a突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

5.权利要求1-4任一项所述的制备方法所制备的Crispr/LbCas12a突变体蛋白。

6.权利要求5所述的Crispr/LbCas12a突变体蛋白在反式切割非常规dsDNA靶标片段中的应用。

7.权利要求5所述的Crispr/LbCas12a突变体蛋白在反式切割含有TTTN PAM的dsDNA靶标片段中的应用。

8.权利要求5所述的Crispr/LbCas12a突变体蛋白在识别并反式切割含有TNTN PAM的dsDNA靶标片段中的应用。

9.根据权利要求6-7任一项所述的应用，其特征在于，步骤如下：

（1）以50μL为体积标准将终浓度为100 nM的Crispr/LbCas12a突变体蛋白和120 nMcrRNA预先混合并在25 ℃下预孵育10 min，形成crRNA/Crispr/LbCas12a复合物；将待测DNA靶标用退火处理形成两个互补DNA寡核苷酸；

（2）步骤（1）的crRNA/Crispr/LbCas12a复合物、两个互补DNA寡核苷酸、400 nM ssDNAFQ-reporter、20 U RNase抑制剂、20nM dsDNA激活剂、5 μL 10×NEBuffer 3.1混匀并添加ddH₂O至50 μL为反应体系，进行反式切割活性测定。