[发明专利]应用于核酸检测的Crispr/LbCas12a突变体蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明属于蛋白功能领域，涉及CRISPR‑Cas系统，特别是指一种用于核酸检测的LbCas12a‑5M突变体蛋白及其制备方法和应用。研究构建了LbCas12a的D156R/G532R/K538V/Y542R/K595R变体，评估蛋白的乱切活性在核酸检测中PAM序列的偏好性以及检测效率方面是否优于野生型蛋白。同时，结合荧光可视化方法，开发出一套可以识别非常规PAM序列的核酸检测系统，进一步优化并扩大了Crispr/LbCas12a核酸诊断系统的应用。

技术领域

本发明属于蛋白功能领域领域，涉及CRISPR-Cas系统，特别是指一种应用于核酸检测的Crispr/LbCas12a突变体蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

CRISPR-Cas系统是存在于细菌和古细菌中的获得应性免疫系统，以保护它们免受噬菌体和病毒的入侵（Barrangou et al.，2007）。某些CRISPR-Cas蛋白（Cas12、Cas13和Cas14）不仅被开发为强大的基因编辑工具，而且在分子诊断方面也有很大的应用前景，因为它们在结合靶标触发顺式切割后，在非特异性靶标上显示出反式切割活性。其中，Cas12a系统通过识别特定的dsDNA序列对ssDNA进行非特异性切割，特别适合于检测病毒（Broughton et al.，2020；chaijaraspong et al.，2019；Li et al.，2019）、病原菌（Sunet al.，2020；Zhang, M. et al.，2020）或转基因生物（Wu et al.，2020；Zhang，Y.-m. etal.，2020）的dsDNA靶标序列。虽然现有的基于Cas12的核酸检测已经成为一种灵敏（aM级）特异的诊断方法，但仍需进一步完善和克服存在的不足之处。所需改进之一就是Cas12a蛋白更倾向于识别基因组中出现频率相对较低的5’-TTTV-3’ PAM（protospacer-adjacentmotif，V表示A/G/C）（Hui et al.，2017），这可能会阻碍crRNA靶标位点的设计，特别是当必须在保守序列区域设计crRNA时。近年来，一些来自不同Cas12a同源物（如Lb-，As-，Fn-，Mb-）的变体被陆续发现，与相应的野生型Cas12a相比，这些变体具有更高的基因编辑效率（kleinsver et al.，2019）或更宽松的PAM限制（Gao et al.，2017）。其中两个AsCas12a变体（AsCas12a-RVR和AsCas12a-RR）分别能识别非常规的TATV和TYCV PAM。enAsCas12a变体（E174R/S542R/K548R）能够将PAM序列扩展到TTYN、VTTV、TRTV等。随后，Toth等人（2020）将这些突变引入LbCas12a，生成LbCas12a-RVRR和impLbCas12a变体，同时也扩大PAM的范围。但是，这些对Cas12a变体的研究，主要集中在顺式切割活性以及基因组编辑效率上，而反式切割活性和PAM位点的偏向性在核酸检测中的应用尚未完全阐明。

发明内容

为了探明上述问题，本发明提出了一种应用于核酸检测的Crispr/LbCas12a突变体蛋白及其制备方法和应用，构建了LbCas12a的D156R/G532R/K538V/Y542R/K595R变体，评估它们在核酸检测中PAM序列的偏好性以及检测效率方面是否优于野生型蛋白。同时，结合荧光可视化方法，开发出一套可以识别非常规PAM序列的核酸检测系统，进一步优化并扩大了Crispr/LbCas12a核酸检测系统的应用。

应用于核酸检测的Crispr/LbCas12a突变体蛋白的制备方法，步骤如下：

（1）将编码野生型LbCas12蛋白的全长基因插入pET-N-His-TEV载体的BamHI和XhoI位点之间，构建pET-LbCas12a-wt载体；

（2）根据编码突变后的LbCas12a蛋白的核苷酸序列，针对D156R、G532R、K538V、Y542R和K595R五个突变位点设计引物，进行PCR定点突变；