[发明专利]Nb.BsrDI酶介导的多重交叉置换扩增结合荧光定量检测新冠病毒的方法

权利要求书

1.一种限制性内切酶介导的多重交叉置换扩增目的基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组；

(2)提供置换引物F1和F2；交叉引物CP1和CP2；扩增引物C1和C2，扩增引物D1和D2，扩增引物R1和R2，同时在所述扩增引物C1、D1或R1的5’端链接如SEQ ID NO:21所示的序列，并被荧光基团标记，并在该引物中间链接荧光淬灭基团；

(3)在步骤(2)所述引物存在及DNA聚合酶的作用下对步骤(1)获得的基因组进行恒温扩增靶基因形成双链扩增产物；

(4)使用Nb.BsrDI酶对步骤(3)获得的双链扩增产物进行剪切；

(5)检测步骤(4)获得的剪切产物的荧光信号。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团HBQ1，或者所述荧光基团为CY5，所述荧光淬灭基团HBQ2。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述引物为：序列分别如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的置换引物ORF-F1和ORF-F2；序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的交叉引物ORF-CP1和ORF-CP2；序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的ORF-C1和ORF-C2的扩增引物；序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的扩增引物ORF-D1和ORF-D2；序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的扩增引物ORF-R1和ORF-R2，其中，步骤(1)还包括使用逆转录酶将待检测样品的基因组RNA序列逆转录为cDNA的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增引物ORF-D1被标记荧光基团FAM，荧光淬灭基团HBQ1。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述引物为：序列分别如SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示的置换引物N-F1和N-F2；序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14所示的交叉引物N-CP1和N-CP2；序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的N-C1和N-C2的扩增引物；序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的扩增引物N-D1和N-D2；序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的扩增引物N-R1和N-R2，其中，步骤(1)还包括使用逆转录酶将待检测样品的基因组RNA序列逆转录为cDNA的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增引物N-D1被标记荧光基团CY5，荧光淬灭基团HBQ2。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述恒温扩增是在60-66℃的环境中进行的。

8.一组用于多重交叉置换恒温扩增SARS-CoV-2的ORF1ab基因的引物，其特征在于，所述引物包括：序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的置换引物ORF-F1和ORF-F2；序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的交叉引物ORF-CP1和ORF-CP2；序列分别如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的ORF-C1和ORF-C2的扩增引物；序列分别如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示的扩增引物ORF-D1和ORF-D2；序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的扩增引物ORF-R1和ORF-R2。

9.根据权利要求8所述的引物，其特征在于，在扩增引物ORF-D1的5’端链接如SEQ IDNO:21所示的序列，并被荧光基团标记，并在该引物中间链接荧光淬灭基团。