[发明专利]Nb.BsrDI酶介导的多重交叉置换扩增结合荧光定量检测新冠病毒的方法

说明书

本发明提供了由Nb.BsrDI(限制性内切酶)介导的多重交叉置换扩增(multiple cross displacement amplification)新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)目的基因结合荧光检测的方法，该方法针对SARS‑CoV‑2的ORF1ab和NP基因扩增并检测该核酸分子，所述方法将逆转录、核酸扩增及Nb.BsrDI介导的序列特异性检测整合到一个反应中，检测结果可以通过收集荧光信号实现，最低可检测到6.8个拷贝数的SARS‑CoV‑2核酸片段。本发明提供的方法具有灵敏高、特异性强特点，可作为临床和现场的检测工具。

技术领域

本发明公开了一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测方法，属于微生 物检测技术领域。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由SARA-COV-2引起的疾病， SARA-COV-2属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性， 与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。SARA-COV-2 传播速度快较快(R₀ 3.28)，早期感染患者仍无症状或无特异性临床症状(如咳嗽、 发热、气短等)，难以确诊，暴露至少2天或2周后才出现明显症状。准确、 快速地识别通过近距离接触传播SARS-CoV-2的新冠患者(尤其是无症状感染 者)是控制SARS-CoV-2快速传播的主要挑战之一。

目前，通过检测SARS-CoV-2的核酸来诊断COVID-19是一种有效的方法。 用于SARS-CoV-2检测的方法主要包括全基因组测序、RT-PCR、等温扩增法、 基因编辑技术、胶体金免疫技术等。全基因组测序对SARS-CoV-2的检测具有 高通量和较好的准确性和精密度，但该方法耗时较长，操作复杂，不适合大规 模检测；RT-PCR对COVID-19感染的诊断具有较高的敏感性、特异性和准确 性，但假阴性检出率较高(仅能检测到约47-60％的阳性COVID-19病例)，检 测耗时约2小时；基因编辑技术具有较高的敏感性和特异性，但需要专用的试剂和专业人员；免疫胶体金技术和酶联免疫吸附技术缺乏特异性和敏感性；当 前主要的检测方法为RT-PCR法。

因此，迫切需要建立一种灵敏度高、特异性强、快速的检测方法。等温扩 增技术是一种操作简单、反应时间短、特异性高、灵敏度高的工具，有助于大 规模检测。本发明的目的是设计一种新型的诊断COVID-19技术，称为核酸内 切酶限制介导的实时逆转录多重交叉置换扩增(E-rRT-MCDA)。E-rRT-MCDA 方法将等温扩增、逆转录和核酸内切酶酶切与实时荧光分析相结合。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种限制性内切酶介导的多重交叉 置换扩增目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组；

(2)提供置换引物F1和F2；交叉引物CP1和CP2；扩增引物C1和C2， 扩增引物D1和D2，扩增引物R1和R2，同时在所述扩增引物C1、D1或R1 的5’端链接如SEQ ID NO:21所示的序列，所述序列可以被限制性内切酶Nb. BsrDI酶所识别，并被荧光基团标记，并在该引物中间链接荧光淬灭基团；

(3)在步骤(2)所述引物存在及DNA聚合酶的作用下对步骤(1)获 得的基因组进行恒温扩增靶基因形成双链扩增产物，在本发明的一个具体实施 方案中，所述DNA聚合酶为Bst 2.0；

(4)使用Nb.BsrDI酶对步骤(3)获得的双链扩增产物进行剪切；

(5)检测步骤(4)获得的剪切产物的荧光信号。

在本发明的一个具体实施方案中，使用荧光定量PCR仪检测步骤(3)的 扩增产物的荧光信号，也可以使用实时浊度基因检测系统对对多重交叉置换扩 增之后产物进行扩增效果验证，阳性能产生浊度曲线，阴性无浊度曲线。