[发明专利]一种基于阻抗检测的数字PCR芯片及其检测方法

说明书

本发明公开了一种基于阻抗检测的数字PCR芯片及其检测方法，该芯片包括基底、微孔阵列和电极。检测过程中，芯片的每个微孔内最多有一个微球，微球表面固定有扩增引物，DNA模板分子掉入微孔中，保证平均每个微孔中不足一个DNA分子。然后在每个微孔内进行PCR反应，通过PCR反应前后的微孔内的阻抗变化获得判断微孔内的阳性和阴性反应，通过计数阳性和阴性反应的微孔数目，根据泊松分布原理计算DNA模板分子的浓度。本发明采用芯片和电信号获取反应结果，与光学检测方法相比，减小了检测设备体积，降低了成本，提高了检测效率，在体外诊断等领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及芯片及其检测方法，具体为一种基于阻抗检测的数字PCR芯片及其检测方法。

背景技术

在DNA分析领域PCR检测应用广泛，通过将DNA的特殊片段放大再经过凝胶成像可以检查PCR过程是否生成了预期的DNA片段，根据凝胶成像的结果可以得出结论。但是凝胶成像耗时过长，同时也只能定性的测量是否有无，没有办法精确的测量DNA的原始的浓度。后面又发展出荧光定量PCR，荧光定量PCR可以通过检测PCR扩增期的荧光增量可以确定靶点的起始量，精度颇高，但是荧光定量PCR耗时长，试剂昂贵，因此有必要对PCR检测技术进行改进。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种能够设置不同频率不同幅值检测电压的基于阻抗检测的数字PCR芯片，本发明的另一目的是提供一种检测迅速、减少不必要溶液转移的基于阻抗检测的数字PCR芯片的检测方法。

技术方案：本发明所述的一种基于阻抗检测的数字PCR芯片，包括基底，基底上设置若干微孔壁，基底或微孔壁的一侧设置微孔和电极，微孔形成阵列排布的微孔阵列，每个微孔内最多有一个微球，微球内设置DNA探针。

进一步地，电极与阻抗测量器相连，阻抗检测器可以使用直流源或交流源进行检测，通过电极对进行微孔内反应液的阻抗检测。通过电极施加交流或直流电场，检测PCR扩增前后的电信号变化，判断微球上是否结合有DNA靶序列，并进而通过数字PCR计算出DNA靶序列的绝对长度。

进一步地，微孔的直径为在1～100μm。直径小于1μm，制作工艺存在困难；直径大于100μm，在检测时存在较大误差。同时，微孔的直径与微球的大小存在关系，常用的微球直径为0.5μm～40μm，有较好的均一性，所以微孔直径选择为1～100μm。每个微孔内设置至少一对电极。

进一步地，电极为方形或圆形，电极材料为铝、铜、金、铂中的任意一种。电极的高0.05～0.6μm，宽为0.1～1.5μm，间距为0.1～2μm。

基于阻抗检测的数字PCR芯片还包括温度传感器，可以作为一个温度触发，设置为同一温度下检测阻抗。温度传感器与热循环器相连，用于使数字PCR芯片在0～100℃内自由转换。

上述基于阻抗检测的数字PCR芯片的检测方法，包括以下步骤：

(a)利用有DNA探针的微球捕获待测DNA靶序列，保证微球数目远远多于DNA靶序列；

(b)将微球和PCR反应液装配到微孔阵列中，保证一个微孔中最多只有一个微球，检测当前状态下的阻抗值；

(c)反应结束后，等待温度回归室温之后进行阻抗检测，通过比较微孔中微球表面PCR反应前后的阻抗变化，测量微球表面是否结合有DNA靶序列；

(d)通过数字PCR计算对DNA靶序列进行绝对定量检测。

进一步地，DNA探针为羧基探针，能够与待测DNA靶序列结合，进行核酸提取与检测。

进一步地，微孔内加入脱氧核苷酸、DNA聚合酶和引物，用于放大样品的DNA。