[发明专利]一种过表达Eaf3p促进酿酒酵母非偏好氮源利用的方法

说明书

本发明公开了一种过表达Eaf3p促进酿酒酵母非偏好氮源利用的方法，属于微生物遗传和分子生物学技术领域。本发明通过将染色质调控因子Eaf3p基因序列连接到高拷贝质粒上，并转化到酿酒酵母中游离表达，增加了酿酒酵母对多种非偏好氮源的利用率，并减少了菌株发酵过程中的尿素积累，为在工业上大大提高原料中的营养成分的利用率、节约成本，同时减少有害氮代谢物积累提供了一种新的策略。

技术领域

本发明涉及一种过表达Eaf3p促进酿酒酵母非偏好氮源利用的方法，属于微生物遗传和分子生物学技术领域。

背景技术

在传统发酵产品，如黄酒等的生产过程中，由于发酵过程中含氮化合物的不完全代谢，造成大量氮源的浪费和发酵食品中氨基甲酸乙酯等有害物质的积累。氨基甲酸乙酯具有神经毒性和较强的致癌性，被国际癌症研究所(IARC)评为2A类有害物质。尿素是氨基甲酸乙酯的重要前体之一，黄酒中约70％-90％的氨基甲酸乙酯是通过尿素与乙醇自发反应生成。

在酿酒酵母细胞中，氮代谢调控是通过多个复杂的调控系统协同作用实现的，其中NCR效应是调节酿酒酵母氮代谢的重要途径。NCR效应调控因子主要涉及正调控因子(Gln3p、Gat1p)和负调控因子及阻遏蛋白(Gzf3p、Dal80p和Ure2p)，这些调控因子可互作调节胞内约10％基因的表达。偏好性氮源的存在导致Gln3p和Gat1p上游的调控因子被激活，从而磷酸化Gln3p和Gat1p，同时活化阻遏蛋白Ure2p，导致Gln3p和Gat1p被阻滞在细胞核外，无法激活非偏好性氮源利用相关基因的转录，从而抑制非偏好氮源的利用。而负调控因子Dal80p和Ure2p主要通过与激活因子竞争基因启动子区域的5′-GATAA-3′位点来抑制Gln3p和Gat1p的活性，以抑制非偏好氮源的利用，导致发酵过程中非偏好氮源大量浪费和有害氮代谢物质的积累。

先前的一项研究分析了酿酒酵母S288C的核小体排列，发现在不同氮源存在下核小体的整体排列存在差异。与优选的氮源相比，在非优选的氮源存在下酿酒酵母的核小体丰度显着增加。通过核小体排列预测的大多数NCR相关基因被上调。核小体是真核染色质的组分。因此，结果表明染色质重塑可能与酿酒酵母中的氮代谢有关。因此筛选能够调节染色质重塑的染色质调控因子有助于实现对酿酒酵母针对不同氮源的利用率的调控作用。

发明内容

在本发明要解决的问题是通过改造染色质调控因子，增加酿酒酵母非偏好氮源利用的方法。

本发明提供了一株尿素积累量降低的酿酒酵母，所述酿酒酵母过量表达了染色质调控因子Eaf3p。

在一种实施方式中，所述染色质调控因子Eaf3p的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述染色质调控因子Eaf3p的编码基因整合至所述酿酒酵母基因组上；所述染色质调控因子Eaf3p的编码基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述染色质调控因子Eaf3p的编码基因连接到高拷贝表达载体上得到重组质粒，再将重组质粒转化到酿酒酵母细胞中。

在一种实施方式中，所述表达载体是pRS424。

在一种实施方式中，所述酿酒酵母是酿酒酵母S288C-trp1单倍体。

本发明还提供所述酿酒酵母的构建方法，是将所述染色质调控因子Eaf3p的编码基因连接至表达载体pRS424上的TEF启动子后，得到重组质粒pRS424-EAF3，再将重组质粒pRS424-EAF3转化单倍体酿酒酵母S288C-trp1细胞中。

本发明还提供了染色质调控因子Eaf3p在降低酿酒酵母对尿素积累能力和增加酿酒酵母非偏好氮源利用能力中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是在酿酒酵母中过量表达染色质调控因子Eaf3p。