[发明专利]用于检测植物内生耐冷假单胞菌的绝对荧光定量PCR特异引物、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种用于检测植物内生耐冷假单胞菌的绝对荧光定量PCR特异引物，其特征在于，包括引物16s1和引物16s9；所述引物16s1包括正向引物16s1-F和反向引物16s1-R，所述正向引物16s1-F的序列如SEQID：1所示，所述反向引物16s1-R的序列如SEQID：2所示；所述引物16s9包括正向引物16s9-F和反向引物16s9-R，所述正向引物16s9-F的序列如SEQID：3所示，所述反向引物16s9-R的序列如SEQID：4所示。

2.一种权利要求1所述的绝对荧光定量PCR特异引物在检测植物内生耐冷假单胞菌基因表达量或在制备植物内生耐冷假单胞菌基因表达量检测试剂或试剂盒中的应用。

3.一种植物内生耐冷假单胞菌基因表达量的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的绝对荧光定量PCR特异引物。

4.一种检测植物内生耐冷假单胞菌基因表达量的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的绝对荧光定量PCR特异引物，以待测植物中提取的DNA样本为模板，建立实时荧光定量PCR检测方法，得出待测植物DNA样本中耐冷假单胞菌基因的表达量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.时荧光定量PCR标准曲线的建立包括以下步骤：

a.植物中提取DNA样品；

b.构建标准品：利用PCR探针扩增引物，以步骤a所得的DNA样本为模板，建立反应体系，进行PCR扩增，将PCR扩增的目的片段进行胶回收测序，确定为目标片段后连接到克隆T载体上，进行转化、复苏、涂板、挑菌、培养、菌检、质粒抽提、测序，验证片段插入后，测定其浓度，计算拷贝数，作为实时荧光定量PCR方法的标准品；

c.绘制标准曲线：将标准品倍化稀释，并计算出不同浓度标准品对应的起始拷贝数，以不同浓度的标准品为DNA模板，利用PCR扩增引物进行实时荧光定量PCR反应，获得对应的扩增动力学曲线；以不同浓度标准品对应的起始拷贝数的对数为横坐标，以循环数阈值为纵坐标，绘制出标准曲线并得到对应的标准曲线方程；

S2.检测：

d.提取待测植物中的DNA样品；

e.PCR扩增：利用PCR扩增引物以步骤d提取的DNA样本为模板，建立反应体系，进行PCR扩增和溶解曲线测定，获得实时定量PCR的Ct值，将所得Ct值带入标准曲线方程中，计算得到待测植物中DNA模板的耐冷假单胞菌基因的拷贝数。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述反应体系16μL：DNA模板稀释样8μL和引物的mixtureA8μL；所述DNA模板稀释样为1μLDNA模板经ddH₂O稀释若干倍；所述mixtureA为10.8μL：2*SYBRreal-timePCRpremixture10μL、10μM的正向引物16s1-F或16s9-F 0.4μL、10μM的反向引物16s1-R或16s9-R0.4μL。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR反应的反应程序为：95℃，5min×1个循环，(95℃，15s；60℃，30s)×40个循环。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，引物16s1的标准曲线为y＝-3.48x+39.19，R²＝0.9971。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，引物16s9的标准曲线为y＝-3.41x+37.14，R²＝0.9987。

10.一种权利要求3-9任一项所述的方法在制备植物内生耐冷假单胞菌基因表达量检测试剂或试剂盒中的应用。