[发明专利]用于检测植物内生耐冷假单胞菌的绝对荧光定量PCR特异引物、试剂盒和检测方法

说明书

本发明属于分子检测技术领域。一种用于检测植物内生耐冷假单胞菌的绝对荧光定量PCR特异引物，包括引物16s1和引物16s9；所述引物16s1包括正向引物16s1‑F和反向引物16s1‑R，所述正向引物16s1‑F的序列如SEQID：1所示，所述反向引物16s1‑R的序列如SEQID：2所示；所述引物16s9包括正向引物16s9‑F和反向引物16s9‑R，所述正向引物16s9‑F的序列如SEQID：3所示，所述反向引物16s9‑R的序列如SEQID：4所示。本发明作为绝对实时荧光定量PCR测定核桃等植物内生拮抗菌在病原物不同侵染时期基因表达量的特异引物，用于区别植物内生耐冷假单胞菌与其他内生细菌。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种用于检测植物内生耐冷假单胞菌的绝对荧光定量PCR特异引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是一项体外扩增核酸片段的基因检测技术，由于PCR技术简单易行、灵敏度高等优点，在临床研究和动植物病原菌检测等方面广泛应用，成为分子生物学必不可少的工具。但普通PCR反应结果需要进行凝胶电泳分析，不能实时监测；且在许多情况下，只得知某一特异DNA序列是否存在，已经不能完全满足研究和实际工作的需要，因而，借助PCR技术对基因进行快速、敏感、特异而准确的定量成为目前分子生物学技术研究的热点之一。实时荧光定量PCR(rel-timequantitationpolymerasechainreaction，Real-timePCR)技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，还以其快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、全封闭反应、可实时监测等优点成为了分子生物研究中的重要工具，目前已得到广发应用。

胶孢炭疽菌引起的炭疽病和层出镰刀菌引起的叶斑病在多地连年发生且分布广泛，影响核桃等农作物产业的健康发展。传统细菌性炭疽病和叶斑病的诊断鉴定是依据症状和病原菌培养特征作出判断，然而症状判断易导致错判，且病原菌分离培养操作繁琐、还需较长生长周期，往往影响及时准确的防治。耐冷假单胞杆菌作为植物内生拮抗菌可有效抑制胶孢炭疽菌引起的核桃炭疽病和层出镰刀菌引起的叶斑病，耐冷假单胞杆菌在植物内部的表达量变化可作为对炭疽病和叶斑病抗性的判断依据。因此，需要一种能快速、准确、高效检测植物内生耐冷假单胞菌基因表达量的方法，以便利用微生态技术为炭疽病和叶斑病的早期防治提供技术支持。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测植物内生耐冷假单胞菌的绝对荧光定量PCR特异引物，对引物序列特异性扩增高,扩增效率接近,线性相关性好,其作为绝对实时荧光定量PCR测定核桃等植物内生拮抗菌在病原物不同侵染时期基因表达量的特异引物，可用于检测耐冷假单胞杆菌菌株中基因在植物内部的表达量变化。

本发明的技术方案如下：

一种用于检测植物内生耐冷假单胞菌的绝对荧光定量PCR特异引物，包括引物16s1和引物16s9；所述引物16s1包括正向引物16s1-F和反向引物16s1-R，所述正向引物16s1-F的序列为CACGTTATGGTGGGCACTCT(SEQID：1)，所述反向引物16s1-R的序列为CAGACTGCGATCCGGACTAC(SEQID：2)；所述引物16s9包括正向引物16s9-F和反向引物16s9-R，所述正向引物16s9-F的序列为CTGGCCTTGACATGCTGAGA(SEQID：3)，所述反向引物16s9-R的序列为ACCGGCAGTCTCCTTAGAGT(SEQID：4)。

一种所述的绝对荧光定量PCR特异引物在检测植物内生耐冷假单胞菌基因表达量或在制备植物内生耐冷假单胞菌基因表达量检测试剂或试剂盒中的应用。

一种植物内生耐冷假单胞菌基因表达量的试剂盒，包括所述的绝对荧光定量PCR特异引物。

一种检测植物内生耐冷假单胞菌基因表达量的方法，利用所述的绝对荧光定量PCR特异引物，以待测植物中提取的DNA样本为模板，建立实时荧光定量PCR检测方法，得出待测植物DNA样本中耐冷假单胞菌基因的表达量。