[发明专利]一种线粒体靶向钙离子探针及其制备方法和采用其构建的工具细胞系

权利要求书

1.一种线粒体靶向钙离子探针，其特征在于，在原始载体的BglII和SalI位点间插入mt-tag序列。

2.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向钙离子探针，其特征在于，所述原始载体为pN1-GCaMPXC。

3.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向钙离子探针，其特征在于，用于插入mt-tag序列的mt-tag正向序列SEQ ID NO.1为：

5’-GGACTCAGATCTCGCCACATGTCCGTCCTGACGCC-3’；

用于插入mt-tag序列的mt-tag反向序列SEQ ID NO.2为：

5’-GATGAGTCGACGGTGGCGACCGGTGGATC-3’。

4.根据权利要求2所述的一种线粒体靶向钙离子探针，其特征在于，采用pN1-GCaMPXC原始载体构建的探针为mt-GCaMPX。

5.根据权利要求1-4任一所述的线粒体靶向钙离子探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)使用限制性内切酶BglII及SalI对原始载体进行酶切PCR反应，37℃酶切过夜，酶切产物使用琼脂糖凝胶电泳进行目的片段分离；

2)使用一步克隆试剂盒将目的片段连接到酶切后的载体上，利用感受态细胞DH5α转化连接产物，将摇好的菌液均匀涂在含有氨苄抗生素抗性的固体LB培养板上，37℃温箱中恒温放置16-18h过夜，次日挑取单克隆菌落于氨苄抗生素抗性的LB培养基中；

3)将抽提好的融合质粒测序，根据测序结果验证目的片段是否插入载体的相应酶切位点且没有移码突变。

6.一种制备线粒体靶向钙离子探针的稳定表达工具细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建如权利要求1-4任一所述的线粒体靶向钙离子探针；

2)利用脂质体将所述步骤1)构建的新立体靶向钙离子探针转染至大鼠细胞中；

3)通过筛选和鉴定获得单克隆的线粒体靶向钙离子探针的稳定表达工具细胞系。

7.根据权利要求6所述的制备线粒体靶向钙离子探针的稳定表达工具细胞系的方法，其特征在于，所述工具细胞系为H9C2细胞系或293T细胞系。

8.根据权利要求6所述的制备线粒体靶向钙离子探针的稳定表达工具细胞系的方法，其特征在于，所述脂质体为Lipofectamine3000脂质体。

9.根据权利要求6所述的制备线粒体靶向钙离子探针的稳定表达工具细胞系的方法，其特征在于，所述步骤3)包括以下步骤：

3.1)在转染24h之后加入550ng/mlG418的培养基进行筛选，每3～5d更换一次含有G418的筛选培养基；

3.2)将经过10天筛选过后的细胞采用梯变倍数稀释的原则接种于96孔培养板中，培养3天左右可见孔中出现单个细胞克隆；在倒置显微镜下观察单克隆中发光程度最接近的细胞，挑出来在96孔板中进行分别培养；

3.3)培养期间，视细胞长势需要决定是否换液，1周左右，孔中有明显克隆出现。待克隆长直孔底面的1/3-1/2时，用消化法将96孔板中的单克隆的细胞分别移至6孔板中进行扩大培养，一般筛选时间至少1个月，此后换无G418的培养基进行培养。

10.根据权利要求6-9任一所述方法制备得到的线粒体靶向钙离子探针的稳定表达工具细胞系。