[发明专利]一种线粒体靶向钙离子探针及其制备方法和采用其构建的工具细胞系

说明书

本发明提供一种线粒体靶向钙离子探针及其制备方法和采用其构建的工具细胞系，所述线粒体靶向钙离子探针为在原始载体的BglII和SalI位点间插入mt‑tag序列；所述原始载体为pN1‑GCaMPXC，进而形成mt‑GCaMPX探针，其在传统线粒体靶向钙离子探针mt‑GCaMP的基础上保留了原有探针的优良属性，同时拥有更高浓度的线粒体钙离子检测范围并能够显著降低氧化应激刺激下的细胞凋亡率以及线粒体损伤，具有良好的实际应用价值。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种线粒体靶向钙离子探针及其制备方法和采用其构建的工具细胞系及制备方法。

背景技术

GCaMPs是一类基于GFP的Ca²⁺荧光探针，GCaMPs经历了多次改进，产生了一系列具有不同光谱、亲和力、高亮度、宽动态范围和快速动力学的探针，被广泛应用于钙成像研究。目前活体细胞的Ca²⁺动态检测工具有限，GCaMPs广泛应用于心血管系统和神经系统，包括GCaMP在内的遗传编码Ca²⁺指示剂(gene coded calcium indicator,GECIs)，以检测细胞质和线粒体Ca²⁺的改变。最广泛使用的GECIs之一是GCaMP6，可用于检测细胞内Ca²⁺对单个动作电位的反应，GCaMP6分为GCaMP6s、6m、6f三种类型，可根据实验需求分别用于慢、中、快动力学变化的钙信号检测。近年来，有多个GCaMPs经融合线粒体靶向序列后被用于线粒体钙稳态机制研究。王显花等(M.Chen et al.,Differential mitochondrial calciumresponses in different cell types detected with a mitochondrial calciumfluorescent indicator,mito-GCaMP2.Acta Bioch Bioph Sin 43,822-830(2011).)合成mt-GCaMP2探针，并将其应用于心肌细胞线粒体钙稳态机制研究(1)；线粒体靶向探针mt-GCaMP5G/6s被用于研究星形胶质细胞和神经元培养过程中的线粒体Ca²⁺动力学机制变化；线粒体靶向探针mt-GCaMP5被用于检测心肌细胞线粒体钙稳态变化。José-Carlos等(J.C.Fernandez-Morales,M.Morad,Regulation of Ca(²⁺)signaling by acute hypoxiaand acidosis in rat neonatal cardiomyocytes.J Mol Cell Cardiol 114,58-71(2018).)将mt-GCaMP6用于研究乳鼠心肌细胞在急性缺氧和酸中毒情况下线粒体钙摄取受抑制情况(2)；Mattia等运用4mtGCaMP6f研究MICU1对线粒体摄取的影响。

研究表明GCaMP具有各种副作用，主要与CaM有关，GCaMP可异常积聚在神经元的细胞核内，引起严重副作用如细胞损伤或死亡，在质粒转染或病毒感染的情况下，GCaMP中CaM高水平或长时间表达更为常见。GCaMP中的CaM过表达可能会损害细胞和组织的整体健康，如GCaMP2转基因小鼠的心脏肥大(类似外源性CaM过表达)，导致其下游CaMKII磷酸化(和活性)的增加以及心钠素的表达。