[发明专利]一种利用CUTTag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂盒及方法

权利要求书

1.一种利用CUTTag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的试剂盒，其特征在于，包括：生物素化的Tn5转座酶、细胞核提取液、洗涤液、抗体杂交液、链霉亲和素洗涤液、DNA洗脱液、一抗、二抗、DNA纯化磁珠、链霉亲和素磁珠、蛋白酶抑制剂、毛地黄皂苷溶液、乙二胺四乙酸溶液、氯化钠溶液、氯化镁溶液、Triton X-100溶液、十二烷基硫酸钠溶液、甘氨酸溶液、预装的Phase Lock Gel凝胶、DNA共沉淀剂和PCR反应液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素化的转座酶由转座酶与生物素化的DNA接头引物孵育形成；

所述生物素化的DNA接头引物由引物A与引物B退火形成的双链接头I和引物A与引物C退火形成的双链接头II构成；

引物A包含转座酶识别的mosaic end(ME)序列片段，5’端磷酸化，3'端氨基(AminolinkerC7)修饰；引物B的3’端为与引物A反向互补的序列，5’端为测序接头序列；引物C的3’端为与引物A反向互补的序列，5’端为测序接头序列；引物B或引物C其中的一个的5’端标记有生物素三甘醇。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Tn5转座酶为pG-Tn5转座酶或pA-Tn5转座酶；细胞核提取液为含有0.5％-1％体积浓度Triton X-100的Tris缓冲液；洗涤液为含有蛋白酶抑制剂和毛地黄皂苷的Tris缓冲液；抗体杂交液为含有EDTA,BSA,蛋白酶抑制剂和毛地黄皂苷的Tris缓冲液；链霉亲和素洗涤液为含EDTA和Tween-20的Tris缓冲液；DNA洗脱液为含醋酸钠和甲酰胺的溶液；DNA纯化磁珠为表面羧基化修饰的磁珠。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括：引物I、引物II和PCR预混液；

所述引物I的碱基序列如SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.15所示序列中的一种；所述引物II的碱基序列如SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.23所示序列中的一种。

5.一种利用CUTTag技术鉴定植物中转录因子与染色质互作的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用生物素化的DNA接头引物与Tn5转座酶孵育，组装形成生物素化的Tn5转座酶二聚体；

(2)固定细胞核内转录因子与染色质的互作状态，提取待测植物组织的细胞核；

(3)利用一抗和二抗识别细胞核内与染色质结合的转录因子，再利用生物素化的转座酶二聚体识别抗体所在区域并切割染色质，形成生物素标记的染色质片段；

(4)利用植物基因组DNA提取液提取反应后的DNA，利用链霉亲和素磁珠对其中生物素标记的DNA片段进行纯化，形成链霉亲和素磁珠-DNA片段混合物；

(5)以链霉亲和素磁珠-DNA片段为模板，进行PCR建库，建立转录因子与染色质互作的高通量测序文库；

(6)文库质检、高通量测序及生物信息学分析；

或者，

(A)利用生物素化的DNA接头引物与Tn5转座酶孵育，组装形成生物素化的Tn5转座酶二聚体；

(B)固定细胞核内转录因子与染色质的互作状态，提取待测植物组织的细胞核；

(C)利用一抗和二抗识别细胞核内与染色质结合的转录因子，再利用生物素化的转座酶二聚体识别抗体所在区域并切割染色质，形成生物素标记的染色质片段；

(D)利用植物基因组DNA提取液提取反应后的DNA，取出一部分DNA溶液中DNA充作荧光定量PCR的input DNA，再利用DNA纯化磁珠结合剩余DNA中的大片段,回收上清溶液；

(E)利用链霉亲和素磁珠对步骤(D)产物中的小片段进行生物素-亲和素纯化，形成链霉亲和素磁珠-DNA片段混合物；

(F)利用DNA洗脱液对结合在链霉亲和素磁珠上的DNA片段进行洗脱；并以洗脱下来的DNA为模板，进行荧光定量PCR；

(G)利用ΔCt方法对荧光定量PCR数据进行分析。